淫羊藿苷調控血栓調節蛋白表達抑制大鼠深靜脈血栓形成的機制*

韓丹 符壯 丁輝

(1.三亞市中醫院中藥房，海南 三亞 572000；2.三亞市中醫院藥學部，海南 三亞 572000；3.海南醫學院基礎醫學與生命科學學院，海南 海口 571199)

深靜脈血栓(Deep venous thrombosis, DVT)是一種靜脈回流障礙性疾病[1]，常見形成于外科手術后的制動狀態，多發于下肢髂股靜脈與腘靜脈。DVT并發肺栓塞所致的靜脈血栓栓塞癥(Venous thromboembolism, VTE)近年來已成為心血管疾病致死的主要誘因[2-3]。常規溶栓及抗凝等治療手段受制于DVT臨床表現滯后、發病迅速、致死率高等特點[4]，并未取得良好的治療效果，因此DVT的預防和早期診斷是關鍵，中醫藥以其“治未病”、高安全性及低副作用等優勢在臨床預防DVT中得到了越來越多的關注[5]。早在《內經·素問》中就有“痹在于骨則重，在于脈則血凝而不流”等關于深靜脈血栓的記錄，現代中醫根據DVT發病機制將其分型為氣虛血瘀型、脾腎陽虛型及濕熱下注型[6]，其中“瘀血”始終貫穿于DVT病發的始末，臨床辨證論治DVT時采用的中醫藥內治方也常以清熱利濕、活血通脈為主，并輔以針灸、外敷、熏洗等外治及綜合治療手段。淫羊藿苷(Icariin, ICA)是中藥淫羊藿中主要活性成分淫羊藿總黃酮(Total flavone of herba epimediumon, TFE)的重要組成部分，ICA在心血管疾病中發揮的潛在降黏解聚、阻滯血瘀、預防血栓作用受到廣泛研究[7-8]，但其藥理作用及治療機制尚未完全闡明，因此本研究通過探究ICA對DVT模型大鼠的治療作用及相關分子標志物的表達變化，旨在闡明ICA治療DVT的機制，為中醫臨床預防及治療DVT提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取10周齡SPF級SD雌性大鼠45只，體質量(220±15)g，購自海南醫學院實驗動物中心。分籠飼養，設置飼養條件為25℃恒溫，50%～60%恒濕，8∶00～20∶00晝夜輪換。實驗動物符合動物倫理要求，并經醫院倫理委員會審核同意。

1.1.2 主要材料與試劑 淫羊藿苷(上海純優生物，批號：489-32-7)；戊巴比妥鈉注射液(Merck，批號：P11011)；生理鹽水(石家莊四藥，批號：20181011)；APTT、PT、TT及FIB檢測試劑盒均購自上海太陽生物技術有限公司(批號：Pc200811，Pc201100，Pc201110，Pc200821)；TM、MCP-1、ICAM-1 ELISA檢測試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司(批號：E-30971、E-44250、E-05953)；TRIzol(Invitrogen，批號：15596018)；反轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(TAKARA，批號：RR047Q、RR036Q)；DEPC水(天根，批號：BL510A)；qRT-PCR所用引物委托生工生物工程有限公司設計并合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 大鼠適應性飼養1周后隨機分為對照組、DVT組及ICA組，每組15只。造模方法參照文獻報道[9]，造模前24 h大鼠禁食，稱重，以30 mg/kg給予大鼠0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉后行仰臥位固定大鼠于操作臺上。剃毛消毒，沿腹中線切2 cm切口，分離并暴露左腎靜脈以下的下腔靜脈分支至髂總靜脈分叉處，用顯微血管夾分別阻斷該段下腔靜脈分支兩端，保持2 h。透壁可見該段血管顏色變為暗紅色，25 g細針穿刺后無血液流出視為造模成功，血栓形成后取下血管夾關腹消毒，全程無菌操作。對照組大鼠采用相同手術方法但不給予血管夾結扎，造模結束后恢復大鼠至活動狀態分籠飼養。ICA融于DMSO后用生理鹽水調節濃度為40 mg/kg舌下靜脈注射治療ICA組大鼠，對照組及DVT組大鼠給予等量生理鹽水，淫羊藿苷藥物使用劑量參照文獻報道[10]，每天1次，連續給藥7 d。

1.2.2 大鼠凝血指標檢測 末次給藥8 h后抽取各組大鼠頸總動脈血2 mL，3000 rpm低速離心10 min，分離血漿，測定3組大鼠活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)以及纖維蛋白原(FIB)含量差異，檢測方法嚴格參照各試劑盒說明書。

1.2.3 HE染色 取血完成后再次開腹截取1～2 cm病變段下腔靜脈，生理鹽水漂洗3次，轉移至4%多聚甲醛中固定8 h或至過夜，常規脫水石蠟包埋后行冠狀面切片，切片厚度5 μm。將切片轉移至載玻片上，脫蠟、梯度酒精水化后先后使用蘇木紫和伊紅染液染色，無水乙醇洗凈后采用苯酚二甲苯與二甲苯封片，中性樹膠固封，將切片置于光學倒置 顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.4 血栓重量檢測 分離下腔靜脈并在結扎下方2 cm處夾閉管腔，分離下腔靜脈內皮與血栓，取出血栓組織塊，吸除多余水分后天平稱重并記錄血栓濕重a(mg)，轉移血栓至培養皿中放在干燥器中，室溫干燥24 h后稱重并記錄血栓干重b(mg)，比較DVT組與ICA組大鼠血栓質量差異。

1.2.5 ELISA檢測血液中蛋白含量 抽取各組大鼠頸總動脈血10 mL于枸櫞酸鈉抗凝采血管中，37℃恒溫水浴0.5 h，2000 rpm低速離心5 min，分離下層血漿。參照ELISA試劑盒說明書分別檢測3組大鼠血漿中血栓調節蛋白(TM)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)及細胞間黏附因子-1(ICAM-1)的含量。

1.2.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測 取上述血栓樣本置于液氮中快速研磨成粉末，加入1 mL TRIzol充分勻漿粉末，參照TRIzol試劑盒說明書依次加入氯仿、異丙醇抽提組織總RNA。核算定量檢測總RNA濃度后標定加入DEPC水調節RNA濃度一致，參照反轉錄試劑盒說明書逆轉總RNA為cDNA，各取100 ng cDNA經qRT-PCR定量擴增后比較各組大鼠相關mRNA表達差異。設置qRT-PCR反應條件如下：預變性95℃ 5 min；擴增循環95℃ 1 min，55℃ 2 min，72℃ 1 min，共40次循環；溶解曲線95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每組樣品設置3個平行副孔，GAPDH為內參引物，以采集到的熒光信號Ct值根據相對定量法計算2-△△Ct用來表示相關mRNA表達水平。

2 結果

2.1 ICA對DVT大鼠血栓形成的影響 HE染色觀察3組大鼠下腔靜脈內血栓形成情況及血管內皮結構變化，結果顯示對照組大鼠下腔靜脈管腔通暢，血管內皮組織細胞結構清晰、排列規則，無血栓形成(圖1A)；DVT組大鼠靜脈腔內可見完全性血栓，血栓與大部分靜脈內皮粘連，內皮細胞消失，血管壁出現大量炎性細胞浸潤，局部可見血栓與管腔內壁存在裂隙，血栓內中央區域有毛細血管形成，血栓機化明顯(圖1B)；ICA組大鼠下腔靜脈內血栓萎縮，多為不完全性血栓，血栓組織僅有少部分與血管壁粘連，管腔裂隙間充斥較多紅細胞，血管壁內皮細胞形態較為恢復(圖1C)。剝離血栓塊后比較DVT組與ICA組大鼠血栓濕重和干重的差異顯示，ICA組大鼠血栓濕重及干重均顯著小于DVT組大鼠血栓(P<0.05)，表明ICA能夠抑制血栓形成及管腔內病理變化，見表2。

表2 DVT組與ICA組大鼠血栓重量比較

圖1 各組大鼠下腔靜脈HE染色(100×)

2.2 各組大鼠相關凝血參數比較 與對照組相比，DVT組大鼠造模后血漿FIB含量顯著升高，APTT、PT、TT均顯著降低(P<0.05)，DVT組大鼠凝血時間較對照組延長；與DVT組相比，ICA組大鼠血漿FIB含量顯著降低，APTT、PT及TT時間升高(P<0.05)，ICA組大鼠凝血時間較DVT組減少，見表3。

表3 ICA對模型大鼠凝血參數的影響

2.3 各組大鼠血漿蛋白表達差異 ELISA檢測結果顯示，與對照組相比，DVT組大鼠靜脈血血漿中TM、MCP-1、ICAM-1蛋白含量均顯著升高(P<0.05)；給予ICA連續給藥治療7 d后，ICA組大鼠血漿TM、MCP-1、ICAM-1含量較DVT組顯著降低(P<0.05)，見表4。

表4 ICA對模型大鼠血漿TM、MCP-1、ICAM-1蛋白表達影響

2.4 各組大鼠血栓組織中相關mRNA表達差異 qRT-PCR檢測結果顯示，ICA組大鼠血栓中給予ICA連續給藥治療7 d后，ICA組大鼠血栓中TM、MCP-1、ICAM-1 mRNA表達較DVT組顯著降低(P<0.05)，見圖2。

3 討論

ICA在早期的藥理學研究中被發現具有抗炎、抗腫瘤、抗組織損傷，促進神經突觸生長及性功能恢復等廣泛作用[11]，同時近年來越來越多的研究表明ICA對心血管系統具有一定的保護作用，其在動脈粥樣硬化、高血壓、心肌缺血及心力衰竭中的作用及分子機制被逐一揭示[12]，但其治療DVT的作用機制仍尚不明確。另一方面，血栓調節蛋白(TM)作為DVT發生發展中重要的標志分子[13]，TM的異常表達與血管內皮細胞損傷和體內抗凝水平相關，現已被證明參與包括PI3K/AKT、FGFR1/FRS2α在內的多種信號通路發揮對動脈粥樣硬化、冠狀動脈慢流等心腦血管疾病的治療作用[14-15]，是近年來衡量多種疾病嚴重程度和預后的重要指標。歷代中醫對DVT的病機及治療均有精辟的論述，并形成了辨證論治、專病專方、內外兼顧的治療方法。ICA作為中藥中成分療效較為明確的一種藥劑，自《神農本草經》中始載入冊后，《本經》、《別錄》、《日華子本草》及《醫學入門》等書籍中先后記載了其在生殖、骨關節、呼吸系統、抗炎癥和抗腫瘤中的突出作用，近年來更是在心血管疾病的治療中受到廣泛的重視，逐步完善并形成了ICA的藥理作用機制及臨床用藥方法。

本研究通過觀察ICA治療DVT模型大鼠過程中TM的表達變化，進一步解釋了ICA治療DVT的分子機制。首先通過解剖分離局部血栓及對內皮和血栓組織切片的染色觀察，結果顯示造模7 d后DVT組大鼠血栓內部出現顯著機化，中央區域形成新生血管再通，下腔靜脈血栓內形成完全性血栓，表明大鼠DVT模型建立有效，而給予ICA治療能夠顯著緩解血栓形成及血栓栓塞局部大小和質量，表明ICA能夠抑制大鼠深靜脈血栓的形成。那么ICA對DVT治療的作用機制又是什么呢？現代醫學認為血栓形成是由血流緩慢、血管壁損傷及血液的高凝狀態三種治病因素綜合作用而形成的，其中尤以凝血異常最為關鍵，由此本研究進一步檢測了ICA對模型大鼠凝血參數的影響，結果顯示ICA能夠有效延長DVT大鼠APTT和TT，查閱以往文獻我們猜測ICA可能是通過抑制內源性凝血因子的活性抑制纖維蛋白生成進而發揮其內源性抗凝作用[16]，此外ICA能夠延長大鼠的PT，PT的大小常反應外源性凝血因子的活性[17]，提示ICA能夠通過抑制外源因子活性干擾纖維蛋白原(FIB)向纖維蛋白的轉化，這一結果也在進一步對靜脈血中FIB含量的檢測中得到印證，給予ICA治療7 d后大鼠體內FIB含量較DVT組顯著降低，體內FIB存在向纖維蛋白的動態轉化，FIB含量降低說明ICA能促進纖維蛋白轉化增加，血漿中凝血因子含量增加近一步增強大鼠抗凝能力。此外，HE染色結果顯示DVT組大鼠血管內皮組織出現大量的炎性細胞浸潤，大量研究表明由凝血異常等動態因素造成的深靜脈血栓臨床常見的腫脹、疼痛的發生與組織內部炎性損傷相關，同時炎性損傷與凝血異常間也存在著緊密聯系，這里我們首先檢測了TM的含量變化。基于上述ICA可能的對內外源凝血反應的抑制作用，TM作為凝血酶-TM-蛋白C(PC)復合物中重要的組成部分[18]，ICA對TM的表達調控進一步解釋了ICA的體內抗凝機制。本研究結果顯示，ICA能夠顯著降低DVT大鼠血漿TM的含量，TM的減少促進了凝血酶活化FIB的能力，由此提高血漿中纖維蛋白的含量，與上述結果一致，提示ICA可能通過調控TM促進抗凝因子的表達進而發揮治療DVT的作用。另一方面，證據表明血漿中MCP-1、ICAM-1等炎性因子介導的炎癥反應與TM的異常表達相關，MCP-1、ICAM-1作為炎癥細胞激活和游走趨化過程的重要分子，ICA能夠顯著降低二者的表達并抑制血栓組織中TM、MCP-1、ICAM-1 mRNA的合成，結合以往文獻報道，我們發現ICA能夠在多種疾病模型中發揮促進SIRT6表達、抑制TM及NF-κB信號通路下游靶基因活化的作用[19-20]，而ICAM-1、MCP-1又是NF-κB信號通路中的關鍵分子，提示我們ICA可能通過調控TM在DVT發病過程中介導NF-κB相關信號分子的轉錄抑制，從而發揮對DVT模型大鼠抑炎、抗凝的綜合治療作用。

4 結論

淫羊藿苷能夠抑制深靜脈血栓大鼠深靜脈血栓的形成，其作用機制與調控血栓調節蛋白表達，抑制下游凝血及炎性因子的活化有關，為闡明淫羊藿苷治療深靜脈血栓的作用機制提供了有力的證據。