miR-493-5p下調METTL3表達影響鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲的研究

張莉 華毛 劉浩明

鼻咽癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，早期患者治療以放療為主，對于中晚期以及復發轉移性患者，放療無法徹底根除腫瘤，隨著對鼻咽癌發病機制的深入研究，分子靶向治療可能是提高鼻咽癌療效的有效策略[1,2]。研究表明miRNA影響鼻咽癌的發生和發展，其可作為腫瘤基因治療的靶點，針對miRNA尋找靶向治療的新方法，可為鼻咽癌的治療開辟一條新的途徑[3]。研究報道miR-493-5p通過靶向Kruppel樣因子5(Kruppel-like factor 5，KLF5)抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡[4]。miR-493-5p過表達促進肝癌細胞凋亡并抑制肝癌細胞的增殖和遷移[5]。過表達miR-493-5p可以抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[6]。然而miR-493-5p對鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響還尚未可知。METTL3是一種mRNA甲基轉移酶，在多種惡性腫瘤中異常表達；如METTL3在非小細胞肺癌中高表達，與患者預后不良相關[7]。METTL3高表達促進口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖、侵襲和遷移[8]。METTL3在鼻咽癌中高表達，通過介導EZH2的M6A修飾來促進鼻咽癌的進展[9]。因此，本實驗研究miR-493-5p對鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響及miR-493-5p是否通過靶向調控METTL3影響鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2019年8月我院病理科存檔且已確診鼻咽癌的組織標本40例，其對應距離癌組織邊緣5 mm處切除的癌旁組織作為對照，患者手術切除癌組織，癌患者手術前未進行過手術及放化療，患者均知情且同意。

1.2 細胞與主要試劑 鼻咽癌5-8F細胞購自上海滬崢生物科技有限公司；RPMI-1640培養液購自杭州吉諾生物醫藥技術有限公司；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購自日本TaKaRa公司；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；抗體購自上海煊翎生物技術有限公司；細胞計數試劑盒8(CCK-8)購自日本同仁化學研究所；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國AAT Bioquest公司；Transwell小室、Matrigel購自美國BD公司；METTL3抗體(orb622739)購自英國biorbyt公司；CyclinD1(PL0502539)、p21(PL0502562)、MMP-2(PL0304135)、MMP-9抗體(貨號：PL0304134)購自加拿大PLLABS公司。

1.3 細胞培養與分組 鼻咽癌5-8F細胞用RPMI-1640培養液培養；取對數生長期細胞，將其稀釋為3×105/ml的密度，接種于6孔板中培養，待細胞融合達到80%時；取0.5 μg的miR-493-5p mimics、miR-493-5p inhi幣投入(anti-miR-NC)及其陰性對照、METTL3干擾質粒及其陰性對照質粒，加入一定量無血清稀釋液，充分混勻，制成稀釋液，終體積為25 μl；取1 μl的轉染試劑，然后加入24 μl無血清稀釋液體，充分混勻，室溫靜置5 min；將上述兩種溶液混合，室溫靜置15 min；將上述復合物加入到5-8F細胞中共培養，混合均勻；培養6 h后更換新鮮培養液，記為miR-NC組、miR-493-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-493-5p組、si-NC組、si-METTL3組；將miR-493-5p mimics分別與pcDNA、pcDNA-METTL3共轉染至5-8F細胞中，記為miR-493-5p+pcDNA組、miR-493-5p+pcDNA-METTL3組。miR-493-5p mimics序列：CTACTGTGTGCCAGGCC；miR-NC序列：GCTTTCATACATGTGGTAG；anti-miR-493-5p序列：GGCTTTCGTACTCTGGCCA；anti-miR-NC序列：TCGTGTTCATTCAGCACA；si-METTL3序列：GCTGAACATACCCGTACTATT；si-NC序列：TTCTCCGAACGTGTCACGTTT。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-493-5p和METTL3 mRNA表達水平 miR-493-5p上游引物序列：5’-TTGTACATGGTAGGCTTTCATT-3’，下游引物序列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游引物序列：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物序列：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；METTL3上游引物序列：5’-GAGGAGTGCATGAAAGCCAG-3’，下游引物序列：5’-GGCCTCAGAATCCATGCAAG-3’；GAPDH上游引物序列：5’-TCTCCTCTGACTTCAACAAGCGACA-3’，下游引物序列：5’-CCCTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。提取組織及細胞總RNA，反轉錄成cDNA，按SYBR Premix ExTaqTM試劑盒說明進行PCR，相對表達量用2-△△Ct法計算。miR-493-5p和METTL3分別以U6和GAPDH為內參。

1.5 蛋白質印跡(Western blot)法檢測METTL3、CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達 提取細胞總蛋白，用BCA試劑盒進行定量；蛋白樣品于10%的SDS-PAGE進行電泳，轉至PVDF膜上，用5 %的牛血清蛋白封閉1 h。加入一抗(稀釋比例1∶800)4℃過夜，TBST洗膜3次；加入二抗(稀釋比例1∶1 000)室溫培養1 h，加入化學發光液顯影，分析各蛋白條帶灰度水平，以目的條帶和GAPDH條帶的灰度值比值作為目的蛋白相對表達水平。

1.6 CCK-8檢測細胞增殖活性 取對數生長期細胞，將其稀釋為3×105/ml的密度，接種于6孔板，培養24 h、48 h、72 h，嚴格按試劑盒說明操作，每孔中加入10 μl CCK-8試劑，在培養箱中孵育2 h后，用酶標儀檢測490 nm處的吸光度值(OD)；以OD值代表細胞活性。

1.7 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 將細胞用無血清培養基以5×105細胞/ml的密度懸浮，遷移實驗：取600 μl含血清培養液和100 μl無血清培養后的細胞懸液，將其分別置于Transwell下室和上室，培養24 h，去除培養液，多聚甲醛固定30 min，加入0.1%結晶紫染色30 min，顯微鏡下隨機觀察5個視野計數，取其平均值即為遷移細胞數；侵襲實驗除用Matrigel包被Transwell上室，其余與細胞遷移操作相同。

1.8 熒光素酶報告實驗檢測miR-493-5p和METTL3的靶向關系 構建METTL3野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-METTL3和MUT-METTL3，將其分別與miR-NC和miR-493-5p共轉染至5-8F細胞中；按照說明書檢測熒光素酶強度，用螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶強度的比值計算相對熒光素酶的活性。

2 結果

2.1 miR-493-5p和METTL3在鼻咽癌組織中的表達 與癌旁組織相比，鼻咽癌組織中miR-493-5p表達水平降低，METTL3 mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 METTL3蛋白表達

表1 miR-493-5p和METTL3在鼻咽癌組織中的表達

2.2 miR-493-5p過表達對鼻咽癌5-8F細胞增殖、遷移侵襲的影響 與miR-NC組相比，miR-493-5p組鼻咽癌5-8F細胞中miR-493-5p表達水平升高，細胞活性降低，細胞遷移、遷襲數降低，鼻咽癌5-8F細胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平降低，而p21表達水平升高(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 miR-493-5p過表達對鼻咽癌5-8F細胞增殖、遷移侵襲的影響(結晶紫染色×200)；A 增殖、遷移侵襲相關蛋白表達；B miR-493-5p過表達對鼻咽癌5-8F細胞遷移侵襲的影響

表2 miR-493-5p過表達對鼻咽癌5-8F細胞增殖、遷移侵襲的影響

2.3 抑制METTL3表達對鼻咽癌5-8F細胞增殖、遷移侵襲的影響 與si-NC組相比，si-METTL3組METTL3表達水平降低，細胞活性降低，細胞遷移、遷襲數降低，鼻咽癌5-8F細胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平降低，而p21表達水平升高(P<0.05)。見表3，圖3。

表3 抑制METTL3表達對鼻咽癌5-8F細胞增殖、遷移侵襲的影響

2.4 上調METTL3表達逆轉了miR-493-5p過表達對鼻咽癌5-8F細胞增殖、遷移侵襲的作用 與miR-493-5p+pcDNA組相比，miR-493-5p+pcDNA-METTL3組鼻咽癌5-8F細胞中METTL3表達水平升高，5-8F細胞活性升高，5-8F細胞遷移、遷襲數升高，鼻咽癌5-8F細胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平升高，而p21表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4，圖4、5。

表4 上調METTL3表達逆轉了miR-493-5p過表達對鼻咽癌5-8F細胞增殖、遷移侵襲的作用

圖4 上調METTL3表達逆轉了miR-493-5p過表達對鼻咽癌5-8F細胞遷移侵襲的作用(結晶紫染色×200)

圖5 METTL3和增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

2.5 miR-493-5p靶向調控METTL3的表達 TargetScan預測顯示 miR-493-5p與METTL3的3’UTR有互補的核苷酸序列。共轉染WT-METTL3與miR-493-5p的5-8F細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)，共轉染MUT-METTL3與miR-493-5p的5-8F細胞熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05)。與miR-NC組相比，miR-493-5p組METTL3蛋白表達水平降低，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-493-5p組METTL3蛋白表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6、7，表5、6。

圖6 METTL3的3’UTR中含有與miR-493-5p互補的核苷酸序列

圖7 METTL3蛋白表達

表5 雙熒光素酶報告實驗

表6 miR-493-5p調控METTL3蛋白的表達

3 討論

鼻咽癌是一種特殊的頭頸部腫瘤，好發于我國南部地區，近年來隨著分子靶向治療的發展，配合手術治療、放化療、靶向治療等的綜合治療成為中晚期鼻咽癌的新的治療方法[10]。研究表明miRNA參與了腫瘤的發生發展等過程，與患者預后相關。miR-493-5p的高表達與非小細胞肺癌患者的臨床預后成正相關[11]。miR-493-5p在肝癌組織和細胞中表達下調，過表達miR-493-5p可通過調控高爾基體蛋白73(GP73)表達抑制肝癌細胞的增殖，促進細胞凋亡[12]。上調miR-493-5p表達通過靶向巖藻糖基轉移酶Ⅳ(fucosyltransferase Ⅳ，FUT4)減弱乳腺癌的侵襲性和致瘤性[13]。本實驗結果顯示，鼻咽癌組織中miR-493-5p表達水平降低；過表達miR-493-5p后5-8F細胞活性降低，5-8F細胞遷移、遷襲數降低；說明過表達miR-493-5p可抑制鼻咽癌細胞增殖，遷移和侵襲。

研究報道鼻咽癌患者癌組織中METTL3高表達，METTL3促進了鼻咽癌細胞的遷移和侵襲[14]。高表達METTL3的鼻咽癌患者的預后較差，敲低METTL3抑制了鼻咽癌細胞的侵襲和遷移能力[15]。本實驗結果顯示，鼻咽癌組織中METTL3表達水平升高；抑制METTL3表達后5-8F細胞活性降低，5-8F細胞遷移、遷襲數降低，說明抑制METTL3表達可抑制鼻咽癌細胞增殖，遷移和侵襲；本實驗結果與前人研究[14,15]結果相符。此外，還有研究報道miR-33a通過靶向下調METTL3表達抑制非小細胞肺癌細胞的增殖[16]。本實驗用TargetScan預測miR-493-5p可能的靶mRNA，結果顯示miR-493-5p與METTL3的3’UTR有互補的核苷酸序列，雙熒光素酶報告實驗證明miR-493-5p可靶向調控METTL3。且本實驗還顯示上調METTL3表達逆轉了miR-493-5p過表達對鼻咽癌5-8F細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，過表達miR-493-5p可能抑制鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其可能與下調METTL3表達有關。