lncRNA LINC00240通過靶向miR-656-3p調控膠質瘤細胞發生發展的分子機制研究

文利偉 張誠 李建明 沈洪波

腦膠質瘤呈浸潤性生長，腫瘤邊緣境界不清，不易切除，且切除后易復發，給患者造成沉重的經濟和心理負擔[1]。隨著科學的發展，靶向治療成為膠質瘤治療的熱點及新方向[2]。研究表明lncRNA對神經膠質瘤的發生發展和其他惡性表型至關重要，可作為潛在的新型生物標志物和治療靶標[3]。研究報道LINC00240與食管鱗狀細胞癌有關[4]。LINC00240在胃癌組織和細胞中高表達，下調LINC00240通過調控miR-124-3p/DNA甲基轉移酶3B(DNA-methyltransferase-3B，DNMT3B)軸可抑制細胞增殖，侵襲和遷移，并且在體內可顯著抑制胃癌細胞的腫瘤發生[5]。然而LINC00240對膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響筆者所見尚不清楚。有研究報道神經膠質瘤細胞系和組織中miR-656表達明顯下調；miR-656過表達通過抑制BMP受體1A型(BMP receptor type 1A，BMPR1A)抑制神經膠質瘤細胞的增殖，遷移和侵襲[6]。lncRNA NORAD通過吸附miR-656-3p促進非小細胞肺癌的增殖和遷移[7]。但miR-656-3p對膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響及LINC00240是否調控miR-656-3p影響膠質瘤進展尚不清楚。因此，本實驗旨在研究LINC00240是否通過調控miR-656-3p影響膠質瘤細胞增殖和凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料 正常人類神經膠質細胞HEB，膠質瘤細胞系LN18、SW1088、Hs683購自ATCC；胎牛血清、RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司；Trizol試劑、熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司；蛋白裂解液、BCA試劑盒購自美國Biomiga公司；MTT試劑盒購自日本同仁研究所；凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國biovision公司。

1.2 細胞處理與分組 正常的人類神經膠質細胞HEB和膠質瘤細胞系LN18、SW1088、Hs683用RPMI-1640培養液常規培養；取對數生長期細胞LN18，將si-NC、si-LINC00240、pcDNA-NC、pcDNA-LINC00240、miR-NC、miR-656-3p轉染至細胞LN18中，分別記為si-NC組、si-LINC00240組、pcDNA-NC組、pcDNA-LINC00240組、miR-NC組、miR-656-3p組；將si-LINC00240分別與anti-miR-NC、anti-miR-656-3p共轉染至細胞LN18中，記為si-LINC00240+anti-miR-NC組、si-LINC00240+anti-miR-656-3p組。

1.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測LINC00240、miR-656-3p的表達水平 Trizol試劑提取細胞總RNA，合成cDNA，按試劑盒說明進行PCR，相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.4 Western blot法檢測蛋白表達 提取細胞總蛋白，定量后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白進行轉膜，封閉，分別加入一抗和二抗孵育，抗體孵育結束后加入ECL發光液進行顯影，最后用Quantity One分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內參計算蛋白相對表達水平。

1.5 MTT檢測細胞活性 細胞培養48 h，加入MTT溶液，孵育后檢測490 nm處吸光度(OD)。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，按試劑盒說明操作；上流式細胞儀檢測。

1.7 雙熒光素酶報告實驗 構建野生型和突變型的LINC00240熒光素酶報告載體，將其分別與miR-NC和miR-656-3p共轉染至LN18細胞中，按試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 膠質瘤細胞系中LINC00240和miR-656-3p表達情況 膠質瘤細胞系LN18、SW1088、Hs683中LINC00240表達水平高于正常人HEB，而miR-656-3p表達水平低于HEB(P<0.05)。見表1。

表1 膠質瘤細胞系中miR-656-3p和LINC00240表達量

2.2 LINC00240低表達對LN18膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組比較，si-LINC00240組CyclinD1表達水平降低，Cleaved-caspase-3表達水平升高，LN18細胞活性降低，凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 LINC00240低表達對LN18膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響；A 流式細胞儀檢測細胞凋亡；B CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表達

表2 LINC00240低表達對LN18膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響

2.3 miR-656-3p高表達對LN18膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-656-3p組LN18細胞中CyclinD1表達水平降低，Cleaved-caspase-3表達水平升高，LN18細胞的活性降低，凋亡率升高，5個指標的組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 miR-656-3p高表達對LN18膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響

圖2 CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達

2.4 LINC00240靶向miR-656-3p LncBase Predicted v.2在線軟件預測顯示，miR-656-3p和LINC00240存在結合位點。miR-656-3p與LINC00240野生型報告質粒共轉染的細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)。與pcDNA-NC比較，pcDNA-LINC00240組miR-656-3p表達水平降低，與si-NC比較，si-LINC00240miR-656-3p表達水平升高(P<0.05)。見圖3，表4、5。

圖3 LncBase Predicted v.2對miR-656-3p和LINC00240結合進行預測示意圖

2.5 低表達miR-656-3p可以逆轉LINC00240低表達對LN18增殖和凋亡的影響 與si-LINC00240+anti-miR-NC組相比，si-LINC00240+anti-miR-656-3p組CyclinD1表達水平升高，Cleaved-caspase-3表達水平降低，LN18細胞活性升高，凋亡率降低(P<0.05)。見圖4，表6。

表4 雙熒光素酶活性檢測

表5 qRT-PCR檢測miR-656-3p的表達

圖4 CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達

表6 低表達miR-656-3p可以逆轉LINC00240低表達對LN18增殖和凋亡的影響

2.6 NF-κB信號通路相關蛋白的表達 與si-NC組比較，si-LINC00240組p-p65、p-IкBα表達水平降低(P<0.05)；與si-LINC00240+anti-miR-NC組比較，si-LINC00240+anti-miR-656-3p組p-p65、p-IкBα表達水平升高(P<0.05)。見圖5，表7。

圖5 Western Blot檢測p-p65、p-IкBα蛋白的表達

表7 NF-κB信號通路相關蛋白的表達

3 討論

研究表明lncRNA參與調控膠質瘤的發生發展過程[8,9]。研究報道LINC00240在宮頸癌中表達增加，LINC00240增強了宮頸癌細胞的生長，遷移和侵襲；LINC00240過表達通過影響miR-124-3p/信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)/MHC I類相關鏈A(MICA)軸抑制了自然殺傷性T細胞的細胞毒活性[10]。本實驗結果顯示，與正常人類神經膠質細胞HEB相比，膠質瘤細胞系LN18、SW1088、Hs683中LINC00240表達水平升高；低表達LINC00240后膠質瘤細胞系LN18中CyclinD1的表達水平降低，LN18細胞活性降低，而凋亡相關蛋白Cleaved-caspase-3的表達水平升高，LN18細胞的凋亡率升高。表明抑制LINC00240表達可抑制膠質瘤細胞增殖，促進細胞凋亡。

另外，miRNA也可能與lncRNA相互作用并影響腫瘤的生長和發展[11]。有研究報道抑制lncRNA ANRIL可通過調節miR-656-3p/Y染色體上的性別決定區相關高遷移率族盒蛋4(SOX4)軸來提高非小細胞肺癌對順鉑的敏感性[12]。lncRNA PCAT1通過海綿miR-656和miR-539上調Yes相關蛋白(YAP)來促進透明細胞腎細胞癌細胞的增殖，遷移和侵襲[13]。本實驗結果顯示，膠質瘤細胞系中miR-656-3p表達水平降低，miR-656-3p高表達可抑制膠質瘤細胞增殖，促進細胞凋亡。且LINC00240靶向miR-656-3p，低表達miR-656-3p可以逆轉LINC00240低表達對LN18細胞增殖、凋亡的影響。提示，LINC00240可能通過調控miR-656-3p影響膠質瘤細胞增殖、凋亡。

有研究報道核因子-κB(NF-κB)信號通路的異常激活與神經膠質瘤的生物學特性改變密切相關，可為神經膠質瘤治療提供新的思路和靶點[14]。干擾轉錄激活因子5(ATF5)可下調NF-κB信號通路降低腦膠質瘤細胞的活力，誘導細胞凋亡[15]。阻斷LINC00152可以通過miR-612/AKT2/NF-κB通路損害間充質表型來抑制膠質母細胞瘤的惡性程度[16]。本實驗結果顯示，LINC00240低表達后p-p65、p-IкBα表達水平降低，表明低表達LINC00240可抑制NF-κB信號通路。而低表達miR-656-3p可以逆轉LINC00240低表達對NF-κB信號通路的影響。

綜上所述，低表達LINC00240可能通過上調miR-656-3p調控NF-κB信號通路進而抑制膠質瘤細胞增殖，促進細胞凋亡。