P-ERK1/2在2型糖尿病合并結直腸癌患者組織中的表達及意義

牛姝 張寧 王媛 張弛 張夢瑤 田碩 趙志剛

結直腸癌(CRC)是最常見的消化道腫瘤之一，嚴重威脅人類的健康，它的發病率已經占惡性腫瘤的第3位，病死率繼肺、肝、胃、食管后第5位[1]。近年來隨著生活水平的提高和人口老齡化，我國2型糖尿病患者呈上升趨勢。2型糖尿病現在已成為世界性非傳染性流行病，全世界現有確診糖尿患者約2.2億。多項研究顯示，2型糖尿病不但可誘發和加重多種全身性疾病，如心腦血管系統疾病，更有增加惡性腫瘤發生的風險，2型糖尿病影響CRC的發生發展、治療及預后[2]。但這一風險性增加的可能機制仍不十分明確。ERK1/2可以將多種細胞外信號，經過磷酸化活化逐級傳遞至細胞核，并激活多種核轉錄因子，參與細胞生長、發育、分裂及分化等[3,4]，是多種生長因子如表皮生長因子(EGF)[5]、神經生長因子(NGF)[6]、血小板源性生長因子(PDGF)[7]等的下游蛋白，在腫瘤侵襲和轉移過程中ERK及其信號途徑起中介和放大信號作用：接受來自絲裂原、生長因子、環境刺激等的信號；通過ERK信號級聯反應作用于核轉錄因子如AP21、NF2kB等，調控基因表達[8,9]。因此探討糖尿病合并CRC中p-ERK1/2 的表達與臨床病理及患者生存的相關性具有重要的應用前景，以期為腫瘤新的觀測指標及治療靶點進一步理清思路，為結直腸癌的防治決策提供有益參考，從而進一步指導患者的臨床治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年3月至2017年1月石家莊市人民醫院病理科經病理明確診斷的結直腸癌手術切除組織標本59例，其中男37例，女22例；年齡≤50歲者4例，>50歲者55例。腫瘤最大直徑<5 cm者19例，≥5 cm者40例；T1～2期7例，T3～4期 52例；高、中分化47例，低分化12例；無淋巴結轉移者34例，有淋巴結轉移者25例。病理分期參照2010年第7版美國癌癥聯合委員會TNM分期標準。其中伴有2型糖尿病CRC患者29例(CRC/DM組)，不伴2型糖尿病CRC患者30例(CRC組)。CRC/DM組與CRC組患者在性別比、年齡等方面有可比性。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①符合2010年WHO消化系統腫瘤分類關于結直腸腺癌的診斷標準，并經術后組織病理檢查確診為結直腸腺癌；②采取手術治療；③所有患者術前均未接受放化療、放療以及其他抗腫瘤治療。

1.2.2 排除標準：①合并其他腫瘤的患者；②合并1型糖尿病的患者。

1.3 病理資料 復習切片，選擇用于免疫組化研究的腫瘤組織；復習所有切片，選擇無明顯退變壞死的存檔石蠟包埋腫瘤組織。

1.4 免疫組化及結果評估 免疫組化染色方法：采用免疫組化SP法檢測59例手術切除癌組織中P-ERK1/2的表達。鼠抗人P-ERK1/2磷酸化單克隆抗體和SP試劑盒、DAB顯色劑均購于北京中杉金橋生物公司，所有流程按試劑盒說明書操作進行染色。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化法(Streptavidin-Peroxidase,SP),癌組織標本采用甲醛溶液固定24 h、脫水、常規石蠟包埋，制作成4 μm厚的石蠟組織切片，常規脫蠟至水化后，60℃烤箱烤片2 h。經常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯，水化后，進行S-P免疫組織化學染色，P-ERK1/2的一抗稀釋度為1∶100，二抗的稀釋度1∶200。采用PBS液代替一抗作為陰性對照，北京中杉金橋公司提供的陽性片作為陽性對照。結果判定標準：所有切片均由2位病理科資深醫生雙盲閱片，2位專家意見不一致時請第3位病理學醫生閱片，最終確定結果。P-ERK1/2蛋白陽性表現為細胞漿和(或)細胞核內有棕黃色或黃色顆粒。P-ERK1/2陽性分級標準：先按陽性細胞所占百分比打分，陽性細胞百分率<5%為0分，5%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；再按細胞的著色強度打分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，參考Zhong等[10]的報道：陽性細胞百分比與細胞的著色強度乘積：評分≤3分為(-)，>3分為(+)。

1.5 隨訪 隨訪截止2020年1月，對所有手術患者進行隨訪術后36個月患者的生存情況，生存時間定義為術后到患者死亡的時間。

1.6 統計學分析 應用SPSS 19.0統計軟件，2組間計數資料的比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法，關聯分析采用Spearman相關分析方法，采用Kaplan-Meier進行生存率相關性分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P-ERK1/2在CRC組和CRC/DM組癌組織中的表達情況 P-ERK1/2棕黃色或黃色顆粒主要在細胞漿和(或)細胞核內表達。30例CRC組的癌組織中有5例P-ERK1/2表達陽性，陽性表達率為16.6%；29例CRC/DM組的癌組織中有12例P-ERK1/2表達陽性，陽性表達率為41.4%，CRC/DM組P-ERK1/2蛋白表達的陽性率明顯高于CRC組(χ2=4.390，P=0.036)。見圖1。

CRC組CRC/DM組

2.2 P-ERK1/2表達與CRC組和CRC/DM組癌組織臨床病理特征相關性

2.2.1 CRC組P-ERK1/2表達與臨床病理特征關系：CRC組P-ERK1/2蛋白陽性表達5例，與患者的年齡、性別、分化程度、腫瘤長徑、T分期和淋巴結轉移均無相關關系(P>0.05)。見表1。

表1 CRC組癌組織中P-ERK1/2的表達與患者臨床病理特征的關系 例(%)

2.2.2 CRC/DM組P-ERK1/2表達與臨床病理特征關系：CRC/DM組P-ERK1/2蛋白陽性表達有12例，與患者的年齡、性別、分化程度、腫瘤長徑、T分期和淋巴結轉移均無相關關系(P>0.05)。見表2。

表2 CRC/DM組癌組織中P-ERK1/2的表達與患者臨床病理特征的關系 例(%)

2.2.3 所有患者P-ERK1/2表達與臨床病理特征關系：不考慮糖尿病，在所有59例患者中P-ERK1/2蛋白陽性表達有17例，P-ERK1/2蛋白陰性表達有42例。女性組10例P-ERK1/2表達陽性，陽性表達率為45.5%，男性組7例P-ERK1/2表達陽性，陽性表達率為18.9%，女性組P-ERK1/2陽性表達率明顯高于男性組(χ2=4.736，P=0.03)。無淋巴結轉移組14例P-ERK1/2表達陽性，陽性表達率為41.2%，有淋巴結轉移組3例P-ERK1/2表達陽性，陽性表達率為12%，無淋巴結轉移組P-ERK1/2陽性表達率明顯高于有淋巴結轉移組(χ2=5.979，P=0.014)；P-ERK1/2的表達與患者的年齡、分化程度、腫瘤長徑、T分期均無相關關系(P>0.05)。見表3。

表3 所有癌組織中P-ERK1/2的表達與患者臨床病理特征的關系 例(%)

2.3 CRC組和CRC/DM組患者術后生存時間和生存率比較 對所有手術患者隨訪手術后36個月患者的生存情況，Kaplan-Meier 生存分析及 Log-rank 檢驗結果顯示，對59例患者隨訪，隨訪時間為1～36個月，中位隨訪時間為29個月。30例CRC組患者中有12例死亡，病死率為40%，29例CRC/DM組患者中有23例死亡，病死率為79.3%，CRC/DM組患者術后病死率明顯大于CRC組(χ2=9.443，P=0.002)。CRC組的中位生存時間是26個月，CRC/DM組中位生存時間是19個月，CRC組患者手術后生存時間明顯大于CRC/DM組(P=0.0304)。CRC/DM組患者較CRC組患者生存率低，病死率高，采用Kaplan-Meier進行生存分析，兩條生存曲線明顯分開(P<0.05)。見圖2。

圖2 CRC組和CRC/DM組患者手術后生存時間比較

2.4 所有患者P-ERK1/2蛋白陽性表達和陰性表達手術后患者生存率比較 不考慮糖尿病，在所有59例患者中P-ERK1/2蛋白陽性表達有17例，有10例死亡，病死率為58.8%；P-ERK1/2蛋白陰性表達有42例，有25例死亡，病死率為59.5%。P-ERK1/2蛋白陽性表達組的中位生存時間是22個月，而P-ERK1/2蛋白陰性表達組的中位生存時間是21個月，P-ERK1/2蛋白陽性表達組與陰性表達組死亡率無明顯差異(P=0.988)。見圖3。

圖3 P-ERK1/2蛋白陽性表達組和陰性表達組手術后生存時間比較

3 討論

伴隨著社會的進步，腫瘤已經成為威脅人類健康的頭號殺手。腫瘤的發生發展是多基因、多因素、多步驟綜合調控、復雜作用的結果。細胞外信號調節激酶ERK1/2是一類屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，它是一種具有傳導絲裂原信號的信號轉導性蛋白。ERK1/2能夠接受各自環境刺激、生長因子或者絲裂原等信號，并且通過ERK信號通路，可以把接受的信號進行級聯反應，并作用于下游因子，最終達到基因表達的調控。磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)是其活化形式，一些生長因子、細胞因子及腫瘤啟動子通過Ras/Raf/MEK/ERK途徑磷酸化激活ERK1/2，活化的ERK1/2(P-ERK1/2)將胞漿內信號導入胞核，作用于c-jun、c-fos、c-Myc、ElK-1等轉錄因子及核蛋白，促進多種癌基因及細胞周期調節相關基因的轉錄與表達。P-ERK1/2通路異常活化提示腫瘤細胞的生物學性質較為活躍，表現為腫瘤細胞增殖加快，容易發生侵襲和轉移，對化療、放療的敏感性降低，患者生存時間縮短[11]。研究發現RAS→RAF→MAPK細胞信號轉導通路激活與惡性腫瘤的發生發展和惡性程度密切相關，貫穿在腫瘤發展的各個階段[12]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是細胞內最重要的信號轉導通路之一，調節細胞的有絲分裂、基因表達。MAPKs是一個蛋白激酶家族，在哺乳動物中發現了5條并行的信號通路，其中ERK1/2級聯通路被認為是經典的MAPKs信號轉導通路之一。既往的臨床研究表明，糖尿病(尤其是2型糖尿病)與多種腫瘤的發生密切相關[13]。事實上，薈萃分析已經證實2型糖尿病是幾種不同類型腫瘤發展的獨立危險因素。Larsson等[14]的研究結論支持糖尿病患者的結直腸癌風險高于非糖尿病患者。Ren等[15]研究結果顯示，在7 938例2型糖尿病患者中就有64例患有結直腸癌(44例結腸癌和20例直腸癌)，其粗發病率為314.8/10萬，其發病率顯著高于普通人群。本研究結果顯示，CRC/DM組的癌組織中P-ERK1/2陽性表達率為41.4%，CRC組的癌組織中P-ERK1/2陽性表達率為16.6%，CRC/DM組中P-ERK1/2的表達率明顯高于CRC組，提示2型糖尿病結直腸癌的發生可能與P-ERK1/2的過表達密切相關，進一步證明磷酸化的細胞外信號調節激酶 1/2蛋白在合并2型糖尿病CRC的發生發展中起重要作用。本研究結果與相關研究結論[12]一致。

在許多研究中提示RAS→RAF→MAPK信號通路可能直接或間接與女性激素相關，女性激素對乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等致病因素已有定論[16]。本研究提示P-ERK1/2磷酸化高表達與腫瘤的性別差異有相關性。不考慮患者有無糖尿病，在所有病例女性患者中P-ERK1/2陽性表達率為45.5%，男性為18.9%，女性組P-ERK1/2陽性表達率明顯高于男性組。但女性激素是否也是結直腸癌的發病因素，尚需大量臨床試驗數據進一步驗證。另外，本研究結果顯示：P-ERK1/2表達與有無淋巴結轉移密切相關：無淋巴結轉移組P-ERK1/2陽性表達率明顯高于有淋巴結轉移組。提示P-ERK1/2在無淋巴結轉移的結直腸癌人群中檢測更有意義，一旦發生淋巴結轉移，該指標可能檢測意義不大。由于本樣本量較小，在今后的研究中需要進一步加大樣本量完成機制方面的研究。

Meyerhardt等[17]的研究顯示，結直腸癌合并2型糖尿病的患者與無糖尿病相比，其結直腸癌的治愈率更低，總體生存率更低，復發率較高，結直腸癌合并糖尿病組的平均生存時間比對照組少5.3年。Dehal等[18]對2 278例轉移性結直腸癌患者進行了10多年的隨訪，結果顯示，合并2型糖尿病患者的死亡風險明顯高于非糖尿病患者。其機制可能為2型糖尿病的高胰島素血癥可通過影響胰島素-胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor-1,IGF-1)軸以及胰島素樣生長因子結合蛋白增加血清IGF-1水平，該因子可促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，與結直腸癌的患病風險有關。之前筆者曾經做過研究顯示：IGF1R和Ras蛋白在CRC/DM組患者癌組織中的陽性表達率均明顯高于CRC組，并且具有IGF1R+ Ras+免疫表型患者所占的比例明顯高于CRC組，二者的表達呈正相關[19]。提示IGF1R/Ras通路可能在合并2型糖尿病CRC的發生發展中起重要作用。我們通過對P-ERK1/2信號下游及IGF1R+ 信號下游的分子進行比對，發現有大多數的共同信號分子：Ras基因，MEK，ERK1/2等，所以我們有理由相信P-ERK1/2與IGF1R+ 信號通路存在著某種聯系，共同參與了結直腸癌的發展。另外，本研究結果顯示，在CRC組的患者術后的中位生存時間是26個月，CRC/DM組的患者術后的中位生存時間是19個月，二者差異有統計學意義(P=0.0304，P<0.05) 。在CRC組患者術后36個月內有40%(12/30)死亡，CRC/DM組患者術后36個月內有79.3%(23/29)死亡，二者差異有統計學意義(P<0.05)。我們的研究結果與相關研究結果一致[15]：結直腸癌合并2型糖尿病組的患者與單純結直腸癌組患者相比，其總體生存時間較低，病死率較高。這說明2型糖尿病可能通過不同的通路參與了結直腸癌的發展。故臨床上應重視2型糖尿病患者的結直腸癌篩查，Nagel等[20]建議，2型糖尿病患者應定期進行結腸鏡檢查，時間間隔不超過5年。重要的是血糖控制也是結直腸癌患者管理的根本策略，通過對血糖良好的控制，使結直腸癌患者有更多的獲益。由于樣本量較少，本研究存在一定程度的局限性，今后有必要進一步增大樣本量來探討2型糖尿病對CRC發生發展的影響，并加強機制方面的研究，以期為臨床診療及預后評估提供更有價值的參考。

CRC/DM組磷酸化的細胞外信號調節激酶 1/2蛋白表達明顯高于CRC組，磷酸化的細胞外信號調節激酶 1/2蛋白可能參與了2型糖尿病患者發生CRC的過程；不考慮糖尿病，在所有59例病例中，女性組P-ERK1/2陽性表達率明顯高于男性組，無淋巴結轉移組P-ERK1/2陽性表達率明顯高于有淋巴結轉移組；2型糖尿病合并結直腸癌組患者與單純結直腸癌組患者相比，其總體生存時間較低，病死率較高。