兒童傳染性單核細胞增多癥臨床特點及淋巴細胞亞群變化的意義

錢冰濤 湯殿維 劉海濤 畢淑英 劉芳 王萌 宋慶

EB病毒(EBV)在人群中感染非常普遍，90%以上的成人血清EBV抗體陽性。EBV主要通過唾液傳播，也可經輸血途徑傳播[1]。了解EBV感染患者的免疫功能狀態和感染后細胞形態，通常都是診斷EBV感染相關惡性腫瘤所必需的[2]。EBV感染40%～70%的癥狀發作患者中可檢出EBV核酸，并且疾病發作后約2周時，檢測陽性率可增至90%[3]。雖然慢性活動性EB病毒感染很少見，但其對多臟器造成不可逆損傷，對于臨床癥狀反復并持續病程3月的患者，一定要盡早識別慢性活動性EB病毒感染[4]。EBV持續感染一般通過外周血中檢測到高水平的EBV-DNA來確診[5]。本文通過對感染EBV的傳染性單核細胞增多癥(IM)患兒的全血EBV-DNA水平進行檢測，比較EBV-DNA陽性組與EBV-DNA陰性組患兒感染EBV后其細胞免疫功能尤其是淋巴細胞亞群的變化特點及其臨床意義，為EBV-IM患兒的個體化治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2019年12月北京航天中心醫院兒科住院并確診為EBV感染的傳染性單核細胞增多癥(IM)臨床資料94例進行回顧性分析。男53例，女41例；男女比例為1.29∶1.00；發病年齡1～14歲，中位發病年齡5.1歲，5歲以下發病56例(59.6%)其中5歲以上發病38例(40.4%)。本研究通過航天中心醫院醫學倫理委員會批準，臨床病例資料均有監護人簽署知情同意書。

1.2 EBV感染的IM診斷標準 滿足臨床指標中的任意3項及實驗室指標中的1項。臨床指標:(1)發熱;(2)咽扁桃體炎;(3)頸淋巴結大;(4)脾大;(5)肝大;(6)眼瞼水腫。實驗室指標:(1)抗 EBV-VCA-IgM和抗 EBV-VCA-IgG抗體陽性，且抗 EBV-NA-IgG抗體陰性;(2)抗 EBV-VCA-IgM抗體陰性，但抗 EBV-VCA-IgG抗體陽性，且為低親和力抗體[6]。

1.3 分組及評估 根據IM患兒入院時EBV-DNA的拷貝數103將全血EBV-DNA分為(拷貝數>103)陽性組36例和(拷貝數<103)陰性組58例，對比淋巴細胞亞群評估免疫功能。入院后予阿昔洛韋抗病毒及對癥支持治療。其中25例EBV感染傳染性單核細胞增多癥患兒入院時淋巴細胞亞群和治療1周后復查淋巴細胞亞群進行對比，評估患兒細胞免疫功能恢復情況。

1.4 方法 采用實時熒光定量PCR分別檢測EBV感染的傳染性單核細胞增多癥確診入院時、治療1周全血EBV-DNA拷貝數。采用BriCyte E6流式細胞儀(T淋巴細胞抗體試劑包括CD3-FITC抗體、CD8-PE抗體、CD45-perCP抗體、CD4-APC抗體；B淋巴細胞抗體試劑包括CD3-FITC抗體、CD16+CD56-PE抗體、CD45-PerCP抗體、CD19-APC抗體。)進行全血標本流式細胞儀自動設門檢測CD3+T細胞、CD4+T細胞(CD3+CD4+)、CD8+T細胞(CD3+CD8+)、B淋巴細胞(CD19+)和NK細胞(CD3-CD16+56+)占淋巴細胞總數的百分比及其絕對值，絕對值測量方法為體積法。CD3+/CD4+比值為計算值。

隨訪：所有IM患兒均通過來院門診復查或電話隨訪。

1.5 統計學分析 使用配對t檢驗比較治療前后淋巴亞群的變化是否有差異，采用基于python的SciPy庫(版本1.4.1,https://www.scipy.org/)實現；Pearson相關系數分析用于比較各項指標之間的相關性，采用“Pandas”進行相關性分析，一個基于Python的包(版本1.0.5；https://pandas.pydata.org/)，使用基于Python的“seaborn”庫(版本0.10.1；https://seaborn.pydata.org/)，以及“matplotlib”庫(版本3.2.2；https://matplotlib.org/)進行相關性熱圖繪制。采用配對t檢驗去比較EBV-DNA陽性組和陰性組、治療前和治療后淋巴亞群的變化是否有統計學差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床癥狀及體征 EBV感染IM患兒的臨床表現多樣，表現為多系統、多器官受累的臨床綜合征，其中以持續發熱、咽峽炎、淋巴結大、肝脾大為主要臨床表現。發熱、頸部淋巴結腫大、咽扁桃體炎典型三聯征癥狀，共74例，占78.2%。病初外周血異型淋巴細胞>10%共64例(68.0%)，異型淋巴細胞<10%共30例(32.0%)。見表1。

表1 EBV感染IM患兒臨床表現及體征

2.2 全血EBV-DNA陽性組和陰性組對比淋巴細胞亞群，評估免疫功能 EBV-DNA陽性組CD3、CD8、CD4絕對值顯著高于陰性組，差異均有統計學意義(P<0.05)；但2組NK絕對值細胞差異無統計學意義(P>0.05)。見表2，圖2。

表2 EBV-DNA陽性組和陰性組淋巴亞群變化比較

組別CD8細胞NK細胞CD3細胞CD4陽性組(n=36)8 800.1±5 098.91 038.3±842.511 528.5±6 460.81 869.6±1 104.9陰性組(n=58)6 491.8±3 848.6801.8±622.58 640.3±4 147.21 453.4±563.8P值<0.05>0.05<0.05<0.05

2.3 25例EBV-IM患兒入院時淋巴細胞亞群水平和治療1周后復查淋巴細胞亞群水平比較 CD8、NK細胞絕對值治療1周后絕對值顯著低于入院時，但仍高于正常范圍，差異有統計學意義(P<0.05)；但2組CD3、B細胞絕對值細胞差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 EBV-IM淋巴細胞亞群治療前后比較

表3 EBV-IM淋巴細胞亞群治療前后比較

時間CD8細胞NK細胞CD3細胞B細胞治療前5 826.4±3 655.7954.4±662.17 859.1±4 255.7440.4±328.0治療后2 869.6±1 646.9656.1±433.24 803.6±2 279.5386.4±278.8P值<0.05>0.05<0.05<0.05

3 討論

本次回顧性研究共94例EBV原發感染導致傳染性單核細胞增多癥患兒，其中發熱、頸部淋巴結腫大、咽扁桃體炎典型三聯征癥狀，共74例，占比78.2%。Rea等[3]的回顧性研究納入500多例患者，發現所有患者都出現淋巴結腫大，98%出現發熱，85%出現咽炎。疲勞癥狀可能持續存在且嚴重。在另一項納入150例患者的前瞻性研究中，大多數初始發熱、咽痛等癥狀在1個月內緩解，而疲勞緩解得較慢， 13%的患者6個月后仍持續存在疲勞[7]。可能存在疲勞癥狀患兒主訴不清楚或臨床醫生未重視等原因，本次研究疲勞癥狀臨床資料并不清晰。EB病毒感染可以引起呼吸系統受累，統計分析本研究中患兒存在咽扁桃體炎79例(84.0%)，診斷肺炎14例(14.9%)，部分患兒出現打鼾等氣道受阻表現，氣道堵塞嚴重者可酌情應用糖皮質激素，防止出現窒息危象。

肝損傷是傳染性單核細胞增多癥常見的早期并發癥，考慮為EBV感染淋巴細胞浸潤引起的自限性的并發癥。本次研究顯示肝大13例(13.8%)，肝功能轉氨酶升高62例(5.3%)，肝功能轉氨酶升高提示肝損傷，患兒口服葡醛內酯片、復方甘草酸苷片保肝治療，規律門診隨訪，復查肝功能轉氨酶均降至正常。本次統計顯示脾大41例(43.6%)，查體脾臟肋下均可觸及，門診隨訪復查腹部超聲，囑家長避免磕碰，免體育運動，均未發生脾破裂。Gayer等[4,5]對該病研究顯示脾破裂相對很少見，大多數病例在診斷為傳染性單核細胞增多癥后3周內出現，發生脾破裂的患者中，其通常在出現癥狀后約14 d發生，但時間范圍可從4 d到長達8周，半數可能自發發生。目前為止筆者還沒有發現關于安全恢復體力活動的共識。在某些少數病例中，脾破裂可能為主訴癥狀[8,9]。因此傳染性單核細胞增多癥應關注脾破裂的風險。IM患兒偶爾可見泛發性斑丘疹、蕁麻疹或瘀點狀皮疹，而結節性紅斑罕見[10]。

本研究顯示患兒病初外周血異型淋巴細胞比例>10%共64例(68.0%)，異型淋巴細胞<10%共30例(32.0%)，異型淋巴細胞比例均數為13%。EBV感染IM外周血異型淋巴細胞多數為CD8細胞毒T淋巴細胞，主要是活化的(HLA-DR+) CD8+ T細胞，也包括CD16+自然殺傷 (natural killer,NK)[11]。異型淋巴細胞多于發病第3天出現，第1周逐漸增多，比例可≥10%，第2～3周達到最高峰，最高可達50%，一般持續5～7周。異型淋巴細胞10%以上的病例早期占比約90%，因此異型淋巴細胞對傳染性單核細胞增多癥的早期診斷具有一定價值。另一項對我國EBV感染傳染性單核細胞增多癥兒童的研究顯外周血異型淋巴細胞>10%的病例占比只有41.8%[12]。一項研究中患者的大多數反應性淋巴細胞是CD8+細胞毒性T細，疾病的嚴重程度與CD8+淋巴細胞增多量及血液中EBV載量有關[13]。EBV特異性細胞毒性T-淋巴細胞被認為對控制急性及再發感染必不可少。T細胞活化導致1型輔助性T細胞產生細胞因子白介素-2和γ-干擾素[14]。

了解EBV感染患者的免疫功能狀態和感染后細胞形態，通常都是診斷EBV感染相關惡性腫瘤所必需的[11]。EBV感染40%～70%的癥狀發作患者中可檢出EBV核酸，并且疾病發作后約2周時，檢測陽性率可增至90%[12]。雖然慢性活動性EB病毒感染很少見，但其對多臟器可能造成不可逆損傷，對于臨床癥狀反復并持續病程3個月的患者，一定要盡早識別慢性活動性EB病毒感染[13]。EBV持續感染一般通過外周血中檢測到高水平的EBV-DNA來確診[14]。所以對于EB病毒感染后臨床癥狀反復，EBV核酸拷貝數持續陽性或復查淋巴細胞亞群仍持續異常的，臨床需警惕慢性活動性EB病毒感染、EBV相關噬血細胞性淋巴組織細胞增多癥等疾病。

CD4 T細胞能夠促進B細胞、細胞毒T淋巴細胞(CTL)和其他免疫細胞的增殖及分化，調節體液免疫和細胞免疫。CD8 T細胞由CTL和抑制性T細胞組成。本次回顧性研究數據顯示EBV感染引起傳染性單核細胞增多癥患兒EBV-DNA陽性組CD4、CD8絕對值顯著高于EBV-DNA陰性組(P<0.05)，因此EBV感染后EBV特異性CD4+和CD8+T細胞反應與EBV活躍復制有關聯，提示特異性CD4+和CD8+T細胞反應對病毒的清除有著重要意義。張翊等[15]回顧性分析IM患兒的臨床資料，IM患兒的CD3+、CD8+細胞比例明顯高于正常對照組(P<0．01)，血EBV-DNA陽性與T淋巴細胞亞群、B淋巴細胞的變化密切相關， EB病毒血癥對病情嚴重程度和預后判斷有一定的臨床價值。

而其他相關報道的慢性活動性EB病毒感染患兒EBV特異的CTL數目和反應均降低或檢測不到。邢燕回顧性研究慢性活動性EBV感染組患兒外周血CD4和CD8 T細胞計數均明顯低于IM組，考慮原因為EBV感染后宿主的正常免疫應答反應很弱或檢測不到，使EBV特異的CTL的數目和功能下調，感染的EBV不易被清除，從而引起慢性活動性EB病毒感染[16,17]。因此，對傳染性單核細胞增多癥患兒常規檢查淋巴細胞亞群，有注意評估患兒EBV感染后免疫功能狀態。陶小娟回顧性分析EBV感染患兒臨床資料，IM組CD8+T細胞較慢性活動性EB病毒感染CAEBV組、EBV-HLH嗜血細胞綜合征組顯著升高(P均<0.05);EBV-HLH組的總T細胞、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、NK及B細胞比其余3組均顯著下降(P均<0.05)。血清中的EBV-DNA水平與疾病種類及嚴重程度呈正相關，EBV感染導致的IM、CAEBV 及EBV-HLH 3種疾病發病機制均與免疫功能紊亂有關; 因此EB病毒感染患兒應注意監測EBV載量和細胞免疫功能，其動態變化可反映EBV感染后免疫狀態和疾病進展的風險[18]。

本次回顧性研究數據中有25例監測淋巴細胞亞群功能，結果CD8細胞絕對值治療1周后顯著低于入院時(P<0.05)，但CD8+絕對值仍稍高于正常值，考慮細胞免疫功能紊亂有所恢復，1個月后門診復診IM患兒復查淋巴細胞亞群多恢復正常范圍，臨床癥狀也均恢復正常，提示患兒預后良好。其他研究顯示IM急性期和IM恢復期患兒TLR2 mRNA,TLR9 mRNA,CD3+和CD8+水平均顯著高于對照組(P<0.01)，且IM急性期均顯著高于IM恢復期(P<0.01)。IM急性期Toll樣受體TLR2mRNA、TLR9mRNA表達相對上調,而IM恢復期二者表達相對下調。IM急性期存在明顯的免疫失衡,即CD3+ CD8+明顯增高,提示在IM病程不同時期TLR2與TLR9的改變可能通過對T細胞的調節參與[19]。

NK細胞是機體天然免疫的主要承擔者，也是獲得性免疫的核心調節細胞。NK細胞缺陷的患者易發生多種危及生命的病毒感染。本次回顧性研究25例EBV-IM患者的監測淋巴細胞亞群功能， NK細胞絕對值治療1周后顯著低于入院時(P<0.05)，但仍稍高于正常范圍。大多數EB病毒感染相關的淋巴增生性疾病起源于EB病毒感染的B細胞，但也可感染CD4+、CD8+ 外周血T細胞和NK細胞[20]。邢燕等[16]回顧性研究慢性活動性EBV感染組患兒外周血NK細胞計數均明顯低于IM組，提示NK細胞減少可能與EBV感染后慢性化相關，考慮與NK細胞缺乏導致CTL功能功能缺失有關。得出結論EBV感染宿主NK細胞、T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞的減少現象可能與慢性活動性EB病毒感染發病有關[16]。HV-LPD是Epstein-Barr病毒陽性T/NK淋巴增生性疾病的一種皮膚形式。患者查血液中淋巴細胞亞群顯示CD4+T細胞數量減少，CD4+/CD8+減少，NK細胞數量減少，B淋巴細胞減少，表明患者的細胞免疫和體液免疫紊亂[21,22]。

綜上所述，EBV感染引起的傳染性單核細胞增多癥兒童外周血異型淋巴細胞增多，即CD8+T細胞明顯增多，在免疫防御中有關鍵作用。IM患兒治療1周后CD8、NK細胞絕對值較入院下降，1個月后淋巴細胞亞群逐漸恢復正常范圍。檢測EBV感染患兒外周血液淋巴細胞亞群有助于EB病毒感染免疫功能評估，幫助EB病毒感染相關疾病的診斷和鑒別診斷。出院隨診監測EBV載量和細胞免疫功能可反映EBV感染后免疫狀態和疾病進展的風險。