白藜蘆醇分離檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

李同夢(mèng)，李明雪

(徐州開放大學(xué)，江蘇 徐州 221000)

白藜蘆醇以反式和順式異構(gòu)體形式存在，是一種植物抗毒素，存在于葡萄藤及其產(chǎn)物、葡萄酒和大量植物中。由于白藜蘆醇具有多種藥理活性，包括抗癌和抗心血管疾病活性以及延長(zhǎng)壽命的特性，其定量方法正在迅速發(fā)展，包括高效液相色譜液法(high performance liquid chromatography，HPLC)、氣相色譜(gas chromatography，GC)和毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis，CE)相關(guān)技術(shù)。本文對(duì)基于分離技術(shù)的白藜蘆醇的分析方法進(jìn)行了綜述，并對(duì)各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較。

1 白藜蘆醇的來源與代謝

白藜蘆醇(3，4’，5-反式三羥基-苯乙烯)是一種天然的從多種植物中提取的非類黃酮的多酚化合物，已被證實(shí)具有抗氧化、抗炎、抗癌癥、抗衰老、減肥、抗糖尿病、心臟保護(hù)等多種生物學(xué)功能[1-2]。白藜蘆醇最初于1940年在白海葵中被分離提取。在1963年，蓼科植物的根中也分離出白藜蘆醇[3]。1997年，Jang等[4]首先報(bào)道了白藜蘆醇的抗白血病作用，隨后對(duì)其廣泛的生物學(xué)和藥理活性進(jìn)行了大量的研究。目前，在天然來源中，白藜蘆醇已在超過72種植物中被發(fā)現(xiàn)，包括葡萄、日本虎杖、花生、桉樹、云杉、百合、桑樹和花生等[5]。其中，葡萄及葡萄酒被證實(shí)是白藜蘆醇最豐富的來源[6]。

雖然白藜蘆醇以反式和順式異構(gòu)體的形式存在，但大部分研究已經(jīng)證實(shí)反式白藜蘆醇的健康作用更大。反式白藜蘆醇的穩(wěn)定性比順式好，順式只有在完全遮光的情況下才在中性pH下穩(wěn)定。相反，反式白藜蘆醇在避光條件下至少穩(wěn)定42 h，除非在高pH緩沖液中[7]。一般來說，在嚴(yán)格的波長(zhǎng)和光照時(shí)間條件下，在強(qiáng)紫外光的照射下，順式白藜蘆醇很容易從其過渡體生成順式白藜蘆醇[8]。但在空氣和不同的光照條件下，反式白藜蘆醇的減少并不總是與順式白藜蘆醇的增加相關(guān)，這可能是由于順式白藜蘆醇對(duì)大氣氧化更加敏感導(dǎo)致的[9]。事實(shí)上，最近有報(bào)道稱，反式白藜蘆醇在365 nm處的紫外光線下能催化異構(gòu)體，除了順式異構(gòu)體外，還會(huì)產(chǎn)生反式-白藜蘆醇的氧化衍生物。因此，與其他抗氧化劑一樣，白藜蘆醇非常不穩(wěn)定，暴露在陽(yáng)光下往往會(huì)作為還原劑，暴露在空氣中會(huì)被氧化。由于氧化可能最終導(dǎo)致白藜蘆醇的完全降解和生物活性的大幅喪失，因此需要一種快速的分析方法來減少白藜蘆醇氧化的機(jī)會(huì)。本文綜述了白藜蘆醇分析的現(xiàn)狀，包括白藜蘆醇的樣品制備和分離檢測(cè)方法，并對(duì)各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)。

2 白藜蘆醇分析樣品的制備

由于不同植物樣品中的白藜蘆醇含量各不相同，因此在白藜蘆醇的分析檢測(cè)前要先進(jìn)行白藜蘆醇提取或濃縮等前處理，以減少基質(zhì)影響。在已報(bào)道的方法中，固相萃取(solid phase extraction，SPE)和液-液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)是應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。

SPE是一種快速、高效的方法，只需要最少的樣品即可操作，并且可以完全自動(dòng)化[10]。因此，它被廣泛應(yīng)用于從生物樣品中濃縮目標(biāo)分析物[11]。不同的研究人員已成功地將該方法用于白藜蘆醇的分析前的濃縮。LLE不像固相萃取那樣被廣泛使用，但LLE也被用于白藜蘆醇的分析。Minuti等[12]使用分離漏斗和乙酸乙酯作為溶劑進(jìn)行了液-液萃取，在葡萄酒樣品中加入氯化鈉(20 mg)和焦亞硫酸鈉(20 mg)，成功地分析了葡萄酒中22種成分的濃度，包括反式白藜蘆醇，平均回收率為73%～107%。有趣的是，當(dāng)對(duì)反式白藜蘆醇的本身進(jìn)行回收時(shí)，這種方法可以得到114%的最好的回收率，顯著好于用同溶質(zhì)C18(EC)玻璃柱測(cè)試的固相萃取方法。

3 白藜蘆醇的分離檢測(cè)方法

對(duì)不同來源的白藜蘆醇進(jìn)行定量研究，有助于幫助我們?nèi)媪私獍邹继J醇的生產(chǎn)、穩(wěn)定性和代謝，以及其有益作用的分子機(jī)制。根據(jù)分離方式的不同，目前白藜蘆醇常用的檢測(cè)方法可分為3大類，即HPLC、GC、CE等方法。本文將總結(jié)這些測(cè)定方法的研究進(jìn)展。

3.1 高效液相色譜法(HPLC)

由于白藜蘆醇的高穩(wěn)定性和高重現(xiàn)性，HPLC是白藜蘆醇及其衍生物分析中應(yīng)用最廣泛的方法。在白藜蘆醇的高效液相分析中，流動(dòng)相、固定相和色譜柱的選擇是影響白藜蘆醇分析效果的因素。白藜蘆醇在大多數(shù)情況下都是在反相柱上進(jìn)行分離的，最常用的流動(dòng)相是乙腈-水體系，它的壓力低于另一種常用的體系甲醇-水。在多數(shù)的情況下，通常使用各種有機(jī)添加劑，如三乙胺、三氟乙酸、甲酸和磷酸等來改善色柱的分離度和峰形[13-17]。據(jù)報(bào)道，乙酸還可以阻止白藜蘆醇中羥基的電離，從而提高其在反相色譜中的保留率。對(duì)于固定相，通常使用多種C18鍵合相用于柱填料，如C18Lichrocart、Capcell Pak C18UG120、ODS Hypersil、Spher ODS等[18-19]以提高對(duì)白藜蘆醇的選擇性和分離度。然而，ODS吸附劑在較高的pH值下易溶解，并且需要較長(zhǎng)的分析時(shí)間。因此，還可以使用芐基二甲基硅基、C8和氰基等鍵合固定相，值得注意的是，C8柱的保留時(shí)間似乎比C18柱短，尤其是順式白藜蘆醇，其在C18柱上的保留明顯較長(zhǎng)[20]。分離的過程中通常采用梯度的洗脫方式進(jìn)行，流速通常在0.5 mL /min和1.5 mL/min之間。洗脫順序按照極性逐步遞減，即反式白藜蘆醇、順式白藜蘆醇依次遞減的順序。

柱屬性是影響白藜蘆醇分析的另一重要因素。Abert Vian等[21]采用兩個(gè)耦合的整體柱分離石榴葡萄酒中的白藜蘆醇和白藜蘆醇異構(gòu)體發(fā)現(xiàn)，整體柱的高孔隙率可以提供很短的平衡時(shí)間，流動(dòng)相流速高達(dá)7 mL/min，僅用較短的分析時(shí)間(20 min)就分離出白藜蘆醇。此外，用于白藜蘆醇分析的高效液相色譜柱尺寸通常為200 mm×4 mm，但微高性能液體色譜法(μ-HPLC)配備有顯著減小的柱直徑(內(nèi)徑約0.2 mm)，被證實(shí)具有更高的靈敏度和更低的檢測(cè)下限，其低流速還可以降低溶劑消耗，較高的柱溫度增加了傳質(zhì)速率，從而進(jìn)一步提高了柱效率，在近年來白藜蘆醇的檢測(cè)方法中引起廣泛關(guān)注[22-24]。Lopez等[22]使用配備有10 cm×0.32 mm的微型高效液相系統(tǒng)成功地測(cè)定了23種意大利商業(yè)葡萄酒中的白藜蘆醇濃度，效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于使用常規(guī)分析柱方法。

3.2 氣相色譜法(GC)

GC已被用于同時(shí)檢測(cè)反式和順式白藜蘆醇，盡管與高效液相色譜法相比報(bào)道較少。通常，由于白藜蘆醇的非揮發(fā)性，在GC分析之前，通過固相萃取或其他方法制備樣品后，需要進(jìn)行化學(xué)衍生化步驟以獲得揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的衍生物。一種常用的衍生化試劑是雙三氟乙酰胺(bistrifluoroacetamide，BSTFA)。也有報(bào)道在比較不同的硅烷化方法后指出，少量的甲醇和BSTFA(約1:3)可顯著提高衍生化產(chǎn)率。電子電離(electron ionization，EI)分子離子在m/z 444處以SIM的模式進(jìn)行定量測(cè)定，m/z 445和446處的離子被記錄為范圍極值。當(dāng)然，含有白藜蘆醇的樣品也可以直接進(jìn)樣(即不經(jīng)過衍生化)進(jìn)行GC-MS分析，其中分子離子在m/z 228處以SIM模式進(jìn)行定量分析，m/z 227([M H]+)和m/z 229(含13C同位素物種)的離子為限定值[25]。研究顯示，在樣品直接進(jìn)樣的情況下，反式白藜蘆醇相對(duì)于順式白藜蘆醇的含量更高，這至少部分歸因于葡萄糖苷形式的熱分解。特別需要注意的是，分析前所需樣品的衍生化以及進(jìn)樣器、色譜柱和離子源(250～300 ℃)使用的高溫可能會(huì)導(dǎo)致白藜蘆醇的部分異構(gòu)化或降解，從而導(dǎo)致GC分析的定量不準(zhǔn)確[26]。

3.3 毛細(xì)管電泳法(CE)

CE具有分離能力強(qiáng)、分離速度快、樣品和溶劑消耗少等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，由于其可用性有限，且其來源如葡萄酒的基質(zhì)高度復(fù)雜，因此對(duì)白藜蘆醇的分析非常有效。原則上，樣品可以直接引入CE系統(tǒng)或經(jīng)過前處理再進(jìn)入系統(tǒng)[27]。盡管樣品的前處理延長(zhǎng)了總的分析時(shí)間，但通常會(huì)產(chǎn)生更濃縮、純度更高的樣品。在CE分析的情況下，固相萃取預(yù)處理能夠?qū)崿F(xiàn)更高的分離效率，因?yàn)樗档土穗x子強(qiáng)度、降低了粘度并便于調(diào)節(jié)運(yùn)行緩沖液，并且由于用于從固相萃取柱洗脫分析物的非極性溶劑產(chǎn)生的堆積效應(yīng)，分辨率也可以提高[27]。盡管SPE程序的有效性取決于隨后的分離模式，但通常使用SPE將植物中的白藜蘆醇檢測(cè)下限降低10倍，并獲得良好的回收率[28]。

在分離模式方面，毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(capillary zone electrophoresis，CZE)和膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC)都被報(bào)道用于白藜蘆醇的分析。CZE中白藜蘆醇的定量分析通常采用磷酸鹽或硼酸鹽基電解液，在分離緩沖液中加入有機(jī)改進(jìn)劑(甲醇)可提高分離度。最近，Peres等[27]以四硼酸鈉(STB)為電解液，利用色譜圖分辨率統(tǒng)計(jì)方程研究了包括STB基緩沖液、甲醇作為有機(jī)改進(jìn)劑、十二烷基硫酸鈉或Brij35作為表面活性劑、進(jìn)樣時(shí)間/壓力、電壓和溫度等各種因素的影響發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的電解液為含20%甲醇的17 mmol/L STB。LOD和LOQ分別為0.1～0.3 μg/mL和0.4～0.8 μg/mL。連續(xù)進(jìn)樣10次，進(jìn)樣時(shí)間和峰面積的RSD均小于2%，回收率在97%～102%之間，分離效果較好。

4 結(jié) 語(yǔ)

鑒于白藜蘆醇的重要藥理作用，人們開發(fā)了一系列的定量方法。其中，GC具有良好的靈敏度和特異度，而分析前所需樣品的衍生化以及進(jìn)樣器、色譜柱和離子源處的高溫可能會(huì)導(dǎo)致白藜蘆醇的部分異構(gòu)化或降解，從而導(dǎo)致不準(zhǔn)確的定量。最常用的HPLC相關(guān)技術(shù)是可靠和穩(wěn)定的，但遺憾的是，它們通常需要很長(zhǎng)的時(shí)間。CE為白藜蘆醇的測(cè)定提供了一種快速、經(jīng)濟(jì)的方法，但由于多種技術(shù)原因，該方法精密度較低，不適合大規(guī)模樣品分析。因此，一種簡(jiǎn)單、快速、可靠、性價(jià)比高的方法仍然需要進(jìn)一步研發(fā)。在這一點(diǎn)上，μ-HPLC具有更廣闊的前景，因?yàn)樗乃俣瓤欤噩F(xiàn)性好，溶劑和樣品的消耗很低，特別是當(dāng)與MS結(jié)合時(shí)[29]。