不同發酵方式對酸筍發酵過程亞硝酸鹽含量 變化的影響研究

崔 娜，惠 翔，王宇軒，王 波，敖宇菲，鞏 僖*

（1.柳州工學院，廣西柳州 545616；2.柳州市螺螄粉植物源性配料研究重點實驗室，廣西柳州 545616；3.柳州市特色食品與品質控制工程技術研究中心，廣西柳州 545616）

酸筍是我國的傳統食材之一，在南方各地區一直被廣泛種植，但是在發酵過程中硝酸還原酶和有害微生物都會使硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽的攝入量也常被用作衡量腌制和發酵食品安全性的重要技術指標之一[1]。因此，應在加工發酵食品時盡量避免亞硝酸鹽的產生，且在食用過程中采取措施降低亞硝酸鹽的攝入量[2]。為了解不同發酵方式對酸筍發酵過程亞硝酸鹽含量變化的影響，本文選取麻竹、冬筍兩種新鮮竹筍，通過接種發酵和自然發酵兩種方式研究酸筍發酵過程中亞硝酸鹽含量的變化，并與市售酸筍進行對比。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冬筍：廣西壯族自治區柳州市柳城縣東泉鎮；麻竹：廣西壯族自治區柳州市柳城縣東泉鎮；普通高度白酒：廣西柳州新福路聯華超市；食鹽：孝感廣鹽華源制鹽有限公司；純水：柳州工學院微生物實驗室；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、硼酸鈉、鹽酸、氨水、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉：西隴科學股份有限公司；濾紙：杭州特種紙業有限公司。

1.2 儀器與設備

JYL-C93T 型榨汁攪拌機：九陽股份有限公司；FW100 型高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；HH-S6 電熱恒溫水浴鍋：江蘇金怡儀器科技有限公司 ；AX124ZH/E 電子分析天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；PV1 型可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；UV-1800 紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；DHG-9070A 恒溫干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；SX-4-10 型箱式電阻爐：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酸筍自然發酵工藝及操作要點

洗壇：使用100 ℃的熱水淋在壇子內壁反復淋洗3 次，最后噴適量75%乙醇消毒，防止酸筍遭到雜菌污染。

竹筍前處理：將新鮮竹筍剝皮，去掉皮、根部和其他不能食用的部分，清洗后切塊至適宜大小，每塊重量約150 g。

入壇發酵：將筍塊置于壇內，加入半壇生理鹽水，然后加入250 mL 老水，再繼續加生理鹽水至壇口，最后加入50 mL 普通高度白酒，封壇發酵。

1.3.2 酸筍接種發酵工藝及操作要點

菌種的活化：取50 μL 乳酸菌LC-3-3[經分子生物學鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）]于MRS 固體培養基中，培養24 h；將菌體轉移至MRS 液體培養基（約50 mL）于37 ℃、160 r·min-1條件下振蕩培養12 h；后吸取1 mL 菌液于MRS 液體培養基（約200 mL）中于37 ℃、160 r·min-1條件下振蕩培養10 h；后離心、洗菌、振蕩，反復收集直至菌體收集完全。最后測定菌液在波長600 nm 處的吸光度值，調整菌液在波長600 nm 處的吸光度值為1，將其作為種子液。培養菌體分別得到2%（等同于 125 mL 菌液）和4%（等同于250 mL 菌液）濃度的菌液，后接種到壇子中[3]。

前處理：使用100 ℃的熱水淋在壇子內壁，反復淋洗3 次，最后噴適量75%乙醇消毒，確保殺死大部分的細菌，防止酸筍遭到雜菌污染。

配制生理鹽水：稱取8 g 食用鹽，用純水定容至1 L（0.8%生理鹽水）；將新鮮竹筍剝皮，去掉皮、根部和其他不能食用的部分，清洗后切塊至適宜大小，每塊重量約150 g。

入壇發酵：將切好的筍塊放入壇中，加入鹽水浸漬，并確保鹽水沒過竹筍，沒有竹筍暴露在空氣中，加入菌液125 mL（2%質量濃度）或250 mL（4%質量濃度）[經過培養活化的乳酸菌（LC-3-3）]起到接種發酵的效果，最后加入50 mL 普通高度白酒，陰涼處封壇發酵。

1.3.3 亞硝酸鹽的測定

根據《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）[4]，采用鹽酸萘乙二胺分光光度法，繪制亞硝酸鈉標準曲線，測定竹筍發酵過程中樣品的亞硝酸鹽含量，分別于發酵前15 天（隔天一測）、第20 天、第25 天、第30 天取樣檢測。

2 結果與分析

2.1 不同品種竹筍自然發酵過程亞硝酸鹽含量變化

由圖1 可知冬筍在自然發酵過程中亞硝酸鹽含量最高為10.1 mg·kg-1（第10 天），發酵30 d 后亞硝酸鹽含量為4.3 mg·kg-1，亞硝酸鹽含量從開始發酵到第9 天逐漸增加，第10 天起緩慢下降。由圖2 可知麻竹在自然發酵過程中亞硝酸鹽含量最高為 9.6 mg·kg-1（第8 天），發酵30 d 后亞硝酸鹽含量為 3.2 mg·kg-1，亞硝酸鹽含量從第0 天到第7 天逐漸增加，第8 天起緩慢下降。

圖1 冬筍自然發酵過程亞硝酸鹽含量變化

圖2 麻竹自然發酵過程亞硝酸鹽含量變化

不同品種竹筍在自然發酵過程中，亞硝酸鹽含量均呈現先上升后下降的趨勢，這主要是由于乳酸菌在發酵初期沒有形成優勢菌群，環境中含有腸桿菌科等有害微生物所需的營養物質、氧氣、適宜的pH 值，因此這些微生物在發酵初期會大量繁殖，亞硝酸鹽含量快速上升。隨著發酵時間的推移，乳酸菌逐漸形成優勢菌群，抑制有害微生物的生長，進而抑制亞硝酸鹽的產生。

2.2 不同品種竹筍接種發酵（2%濃度）亞硝酸鹽含量變化

由圖3、圖4 可知冬筍在接種發酵過程中（2%濃度），亞硝酸鹽含量最高為8.9 mg·kg-1，發酵30 d后亞硝酸鹽含量為3.7 mg·kg-1；麻竹在接種發酵過程中（2%濃度），亞硝酸鹽含量最高達到6.7 mg·kg-1，發酵30 d 后亞硝酸鹽含量為2.1 mg·kg-1；亞硝酸鹽含量均呈先上升后下降的趨勢。亞硝酸鹽達到峰值的時間均比自然發酵提前了3 ～5 d，且最高值均有下降，主要原因可能是環境內并未生成大量有害菌，乳酸菌在發酵初期就占據主導地位，成為優勢菌群，因此，亞硝酸鹽含量被控制在較低的程度。

圖3 冬筍接種2%乳酸菌發酵亞硝酸鹽含量變化圖

圖4 麻竹接種2%乳酸菌發酵亞硝酸鹽含量變化圖

2.3 不同品種竹筍接種發酵（4%濃度）亞硝酸鹽含量變化

由圖5、圖6 可知冬筍在接種發酵過程中（4%濃度），亞硝酸鹽含量最高為7.3 mg·kg-1，發酵完成后亞硝酸鹽含量為4.1 mg·kg-1；麻竹在接種發酵過程中（4%濃度），亞硝酸鹽含量最高達到6.7 mg·kg-1，發酵完成后亞硝酸鹽含量為2.7 mg·kg-1；亞硝酸鹽含量均呈先上升后下降的趨勢。亞硝酸鹽達到峰值的時間均比自然發酵提前，且最高值均有下降，但與2%濃度接種發酵沒有顯著性差異。主要原因可能是發酵初期環境內并未生成有害菌，但是在實驗中期亞硝酸鹽含量逐步提升，其原因可能是存在外界污染的情況，導致酸筍液中有害微生物提升，破壞了原有的微生物內環境，進而導致亞硝酸鹽含量升高；實驗后期當乳酸菌重新占據主導地位，成為優勢菌群時，亞硝酸鹽含量又逐漸降低。冬筍的亞硝酸鹽含量始終高于麻竹，有可能是冬筍品種自帶有益菌群較少，不利于長時間發酵加工，易被雜菌污染[5-7]。

圖5 冬筍接種4%乳酸菌發酵亞硝酸鹽含量變化圖

圖6 麻竹接種4%乳酸菌發酵亞硝酸鹽含量變化圖

2.4 自制成品酸筍與市售酸筍中亞硝酸鹽含量的對比分析

根據圖7 中的對比分析可知，市售酸筍中的亞硝酸鹽含量均高于自制成品酸筍，其原因可能是市售散裝酸筍的發酵及保存環境較差，易受污染，且貯存時間較長導致微生物的二次污染。市售酸筍與自制接種發酵酸筍對比后，差異性較為明顯，自制接種發酵的兩個品種的竹筍亞硝酸鹽含量普遍低于市售酸筍，其主要原因在于發酵工藝的不同以及發酵時間的差異，酸筍中乳酸桿菌的代謝產物乳酸降低了酸筍液環境內的pH，抑制絕大多數有害菌的生長，使其無法將氨基酸脫羧為生物胺，把硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，從而起到了抑制亞硝酸鹽產生的效果，因此接種發酵更利于加工酸筍時對亞硝酸鹽的控制。

圖7 自制成品酸筍（發酵30 d 后）與市售酸筍中亞硝酸鹽含量對比分析圖

3 結論

本研究對比了麻竹、冬筍兩個品種以及接種乳酸桿菌發酵與自然發酵兩種發酵方式分別對酸筍發酵過程亞硝酸鹽含量的影響，得出酸筍發酵過程中亞硝酸鹽含量呈現先增加后減少的趨勢，其含量最高峰為10.1 mg·kg-1，成品酸筍亞硝酸鹽含量均低于4.5 mg·kg-1，達到國標限量要求（＜20 mg·kg-1）；麻竹發酵產生的亞硝酸鹽含量顯著低于冬筍，接種發酵產生的亞硝酸鹽含量顯著低于自然發酵；此外，在接種發酵中，還觀察到并不是乳酸菌的濃度越高，亞硝酸鹽抑制效果越好，仍需要通過后續實驗篩選到合適的乳酸菌品種及接種濃度。