液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中氯霉素殘留量

謝冬霞

（深圳三方圓檢測監管服務有限公司，廣東深圳 518110）

氯霉素作為一種廣譜抗生素，對革蘭氏菌（陰性菌和陽性菌）有很好的抑制作用，因其具有穩定的藥性、良好的抗菌性和價格低廉，曾在一段時間內作為細菌性疾病的治療藥物，在畜禽和水產養殖業中廣泛應用。但人們在使用中發現氯霉素具有毒性，且CAP 會在動物性食品中殘留，通過動物性食品對人的健康產生毒害作用[1]。研究表明，氯霉素存在嚴重的副作用，可引起人體的再生障礙性貧血、粒狀白細胞缺乏等疾病，因此殘留在動物源性食品中的氯霉素對人類的健康構成了潛在的危害[2]。世界上很多國家禁止食源性動物使用氯霉素，我國農業農村部發布的第250 號公告也禁止其在食品動物中使用。目前，氯霉素的檢測方法主要有酶聯免疫法、金標試紙條法、高效液相色譜法、氣相色譜法和液相色譜-串聯質譜法等[3-5]，其中液相色譜-串聯質譜法以其選擇性高、靈敏度高、重現性好的優勢，成為畜禽產品中氯霉素的常用檢測方法。本研究參照 GB 31658.2—2021[6]，結合實驗室設備條件和檢測需求，建立了液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中氯霉殘留量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉（購于某農貿市場）。

氯霉素標準品（編號BW300320200， 純度99.80%， 品 牌LGC）；氯霉素-D5（ 編 號BW901405-100-H，濃度為100 μg·mL-1，壇墨質檢科技股份有限公司）；甲醇（色譜純，賽默飛）；乙腈（色譜純，賽默飛）；正己烷、乙酸乙酯、氯化鈉（分析純，西隴科學）；C18固相萃取柱（500 mg/3 mL，購于逗點生物）；實驗用水符合GB/T 6682—2008二級。

1.2 儀器與設備

U1timate3000+TSQ Fortis 高效液相色譜質譜聯用儀（美國賽默飛公司）；HZ-104/35S 分析天平（福州華志科學儀器）；JP-240ST 超聲（深圳市潔盟清洗設備有限公司）；DC-24氮吹儀（上海安譜科學儀器）；DDL5 大容量冷凍離心機（長沙英泰儀器有限公司）；WH-3 渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；明澈-TD 24UV 超純水系統（Millipore）。

1.3 試樣處理過程

稱取5.00 g 試樣于50 mL 離心管中，加入 250 μL 內標工作液、5 mL 乙腈、5 mL 4%氯化鈉溶液，振蕩渦旋2 min，于4 000 r·min-1離心機中離心8 min，取上清液，重復提取1 次，上清液合并。加5 mL 正己烷，振蕩渦旋1 min，于2 000 r·min-1離心8 min，丟棄上層液，重復處理1 次。加5 mL（水飽和的）乙酸乙酯，振蕩渦旋1 min，2 000 r·min-1離心8 min。上層液轉移至新的15 mL 離心管，水飽和的乙酸乙酯重復提取1 次，提取液合并，用氮氣吹干，加入3 mL 水-乙腈（95 ∶5，v/v）溶解，備用。

取C18固相萃取柱，依次用10 mL 甲醇、10 mL 水預洗。取備用液過柱，加3 mL 水洗柱，重復1 次，加4 mL 甲醇-水（50 ∶50，v/v），以1 mL·min-1的速度進行洗脫，用15 mL 離心管收集洗脫液。加4 mL 水飽和乙酸乙酯，振蕩渦旋1 min，于2 000 r·min-1離心機離心5 min，取上層液，加4 mL 水飽和乙酸乙酯重復處理1 次，上層溶液合并，氮氣吹干。加1 mL 甲醇-水（50 ∶50，v/v）溶解，取上清液過0.22 μm 濾膜后上機分析。

1.4 標準系列溶液配制

氯霉素標準儲備液：準確稱取10 mg 氯霉素，用甲醇稀釋、定容至100 mL 容量瓶中，搖勻，配制成100 μg·mL-1的標準儲備液。

氯霉素標準工作液：準確量取適量氯霉素標準儲備液，用甲醇-水（50 ∶50）分別稀釋成濃度為100 ng·mL-1、50 ng·mL-1和10 ng·mL-1的標準工作液。

氯霉素內標工作液：準確量取適量氯霉素-D5原液，用甲醇-水（50 ∶50）稀釋成濃度為20 ng·mL-1的內標工作液。

標準系列溶液：用流動相配制成濃度為 0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1，內標濃度為5 ng·mL-1的標準系列溶液，詳見表1。

表1 標準溶液配制表（單位：μL）

1.5 儀器分析條件

1.5.1 液相色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD Silica（2.1 mm×100.0 mm，1.9 μm）；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：2 μL。流動相：甲醇（A）+水（B），梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序表

1.5.2 質譜工作條件

離子源：H-ESI；離子模式：負離子；掃描模式：多重反應監測（MRM）；離子源溫度：350 ℃；鞘氣：35 arb；離子轉移管溫度：300 ℃；輔助氣：8 arb；尾氣：0 arb；監測離子參數情況見表3。

表3 氯霉素特征離子質譜條件表

2 結果與分析

2.1 方法的線性關系

將配制的標準系列溶液在1.5 儀器條件下上機測試，以特征離子質量色譜峰外標與內標峰面積的比值為縱坐標，相對應的標準溶液的濃度點作為橫坐標，采用色譜工作站自動擬合標準工作曲線，線性回歸方程為y=0.199 8x+0.483 9，相關系數為0.999。結果表明，氯霉素在0.5 ～20.0 ng·mL-1線性關系良好，見圖1 相關系數R大于0.995，滿足相關標準對線性關系的規定。

圖1 氯霉素標準工作曲線圖

2.2 檢出限與定量限

稱取5.00 g 陰性豬肉，加入0.01 mL 濃度為 0.5 μg·kg-1氯霉素標準溶液（即加入量為0.1 μg·kg-1），按照1.3 試樣處理過程、1.5 儀器條件分析測定，測得氯霉素的信噪比S/N為683.98，大于3.0，本方法中氯霉素的檢出限為0.1 μg·kg-1；稱取5.00 g 陰性豬肉，加入0.02 mL 濃度為0.5 μg·kg-1氯霉素標準溶液（即加入量為0.2 μg·kg-1），按照1.3 試樣處理過程、1.5 儀器條件分析測定，測得氯霉素的信噪比S/N為3 453.11，大于10.0，本方法中氯霉素的定量限為 0.2 μg·kg-1，檢出限與定量限均滿足標準相關要求。

2.3 加標回收率及精密度

稱取陰性豬肉樣品，分別添加低（0.20 μg·kg-1）、中（1.00 μg·kg-1）、高（2.00 μg·kg-1）3 個濃度水平的氯霉素標準溶液，按照1.3 試樣處理過程、1.5 儀器分析條件將各濃度水平平行測定6 次，考察方法的加標回收情況與精密度（以相對標準偏差RSD 表示），試驗結果見表4。氯霉素在0.20 ～2.00 μg·kg-1添加水平下，回收率在72.2%～109.0%，相對標準偏差RSD 在1.7%～7.1%，回收率與精密度均符合方法標準規定。

表4 加標回收率與精密度試驗結果

3 結論

本研究參照GB 31658.2—2021 建立了液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中氯霉素殘留量的分析方法，該方法前處理過程簡便、分離效果好、分析速度快，可進行準確定性定量分析，經過方法學驗證，該方法線性關系良好，檢出限與定量限、加標回收情況及方法精密度都滿足相關標準的規定，可滿足食品檢驗檢測機構對豬肉中氯霉素殘留的批量快速檢測需求。