超高效液相色譜串聯質譜法測定豆芽中的 尿素含量

吳基任，梁鳳雅，林 青，楊茲偉，魏 靜，梁曉涵

（海南省食品檢驗檢測中心，國家市場監管重點實驗室（熱帶果蔬質量與安全），海南海口 570314）

豆芽，也稱豆芽菜，又名芽心、大豆芽、如意菜等，被譽為“活體蔬菜”。豆芽容易消化，中醫理論認為豆芽具有清熱解毒、健脾養肝的作用。豆芽含有豐富的鈣、鐵、鉀、鋅等微量元素及多種維生素、纖維素，適量食用可以預防口角發炎、便秘。豆芽一般采用水浸泡發芽、無土栽培。但是無良商販在豆芽生產的過程中常施用尿素，以提升豆芽產量及縮短生產周期[1]。人如果長期食用含有大量尿素的豆芽，會在體內生成亞硝酸鹽，可能增加人體患癌的可能性[2]。上述栽培方法不可避免地會產生尿素殘留物，但沒有引起注意，因為人們更多地關注豆芽上的植物生長調節劑（6-芐基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸）殘留[3]。

尿素是一種高水溶性的有機化合物，具有低急性毒性，半數致死量（LD50）為15 g·kg-1。尿素進入人體后會刺激胃腸道，引起惡心、嘔吐和腹瀉，長期或反復攝入尿素可能導致不良生殖影響和目標器官損傷。此外，尿素溶于水中時產生的氨分子是一種具有高度刺激性和毒性的分子，大鼠的半數致死量（LD50）為350 mg·kg-1。尿素的分子結構沒有明顯的發色團和熒光團，因此目前測定尿素的分析方法需要進行衍生，否則很難克服來自復雜基質的干擾[4-5]。由于尿素是極性分子，在反相色譜中與樣品基質中其他極性化合物的分離分辨率較低[6]，而在質譜檢測中也不可避免地存在較強的基質干擾或離子抑制[7]。研究表明，親水相互作用色譜法在極性化合物的分離中具有較高的分辨率[8-9]，為尿素反相色譜測定中遇到的問題提供了解決方案。因此，本文研究了親水相互作用色譜-質譜法測定尿素的可行性，并將該方法應用于測定豆芽中的尿素含量。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品分為兩部分：一部分為自培，共16 批；另一部分樣品為課題組從農貿市場購買的豆芽，共16批。所有的樣品在采收或購買當天均按照GB 2763—2021 的規定進行取樣，取得的樣品將其切碎，置于組織搗碎機內搗碎勻漿，放入聚四氟乙烯瓶中，于 -18 ℃條件下保存直至測定。

1.2 儀器與試劑

Nexera X2 超高效液相（日本島津公司）；TRIPLE QTRAP 5500 三 重 四 極 桿 質 譜 儀（ 美 國SCIEX 公司）；MS 3 digital 振蕩器（德國艾卡公司）；Centrifuge 5804R 高速離心機（德國艾本德公司）；DTA-33 超聲波提取器（湖北鼎泰恒勝公司）；Autovap S60 氮吹儀（美國ATR 公司）；XS-204 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Simpliclty超純水制備儀（美國密理博公司）；陶瓷均質子（上海安譜科學儀器有限公司）；ACQUITY UPLC BEH Amide 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），美國沃特斯公司）；0.22 μm 聚四氟乙烯微孔濾膜（天津領航實驗設備有限公司）。

甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，美國賽默飛世爾科技公司）；甲酸銨（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；尿素標準品（廣州佳途科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

尿素標準貯備溶液：準確稱取50 mg（精確到 0.1 mg）尿素標準品，加7.5 mL 去離子水溶解，用乙腈定容至50 mL，配制成1 mg·mL-1的尿素標準儲備液，轉移到50 mL 棕色螺紋瓶，密封存貯于 -20 ℃冰箱中。

尿素標準工作液：準確移取適量尿素標準儲備液，用乙腈-水（85 ∶15，V/V）溶液配制成1 mg·mL-1的標準工作液。

1.3.2 樣品處理

準確稱取2 g（精確至0.001 g）樣品于50 mL的具塞聚四氟乙烯離心管中，加入20 mL 乙腈-水（85 ∶15，V/V），2 粒陶瓷均質子，超聲處理 5 min。在10 000 r·min-1下離心5 min，移取上清液至50 mL 容量瓶中，殘渣再次加入20 mL 乙腈-水（85 ∶15，V/V）重復提取一遍，合并上清液，最后用乙腈-水（85 ∶15，V/V）定容混勻，過0.22 μm 尼龍濾膜，上LC-MS/MS 測定。

1.3.3 尿素標準曲線配制

使用1.3.2 處理方法獲得空白基質液，將尿素標準工作液配制成系列基質標準曲線。

1.3.4 儀器分析條件

（1）色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈 -0.5% 甲酸銨水溶液（85 ∶15，V/V），等度洗脫；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

（2）質譜條件。離子源：電噴霧離子（Electrospray Ionization，ESI）源；掃描模式：正離子掃描，多反應監測模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；碰撞氣：氮氣；電噴霧電壓：4.0 kV；離子源溫度：300 ℃； 霧化 氣（Nebulizer Gas，GS1）：50 psi； 加熱 氣（Heating Gas，GS2）： 50 psi；氣簾氣（Curtain Gas，CUR）：20 psi；碰撞室入口電壓（Entrance Potential，EP）：10 V；碰撞室出口電壓（Collision Cell Exit Potential，CXP）： 16 V；優化后的MRM 參數見表1。

表1 質譜參數

2 結果與分析

2.1 液相、質譜條件優化

由于尿素是一種高極性的有機分子，它在經典反相柱上的保留效果很差，無法與基質峰進行有效的分離。在方法開發過程中，對Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）、ACE Excel 3 C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）和Phenomenex Kinetex XB-C18（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）等反相柱進行了測試；在所有被測試的反相柱上都觀察到了強烈的離子抑制和基質效應，這歸因于極性化合物的過早洗脫。最后，為了更好地保留被分析物以達到預期的分離效果，以ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色 譜柱（氨基色譜柱），乙腈-0.5%甲酸銨水為流動相的親水相互作用色譜被成功地應用于目標化合物的分析。采用乙腈-0.5%甲酸銨水（85 ∶15，V/V）為流動相，尿素的保留時間為2.01 min，每個樣品的運行時間在5 min 以內。

評估了在正負離子掃描模式下使用電噴霧電離（ESI）的可能性，結果表明，ESI 在正離子掃描模式下可以為分析物提供更高的MS 響應靈敏度和穩定性，從而提高了分析的性能。因此，本研究選擇了ESI 正離子模式。

2.2 方法特異性研究

通過對不同來源（自培、外購）豆芽樣品的分析，確定了該方法的特異性，以評估可能的基質干擾。對樣品前處理和儀器色譜條件進行了優化，以保證尿素保留時間不受干擾。結果表明，分析物的保留時間沒有受到干擾，見圖1。

圖1 樣品MRM 質譜圖

2.3 線性范圍、檢出限、定量限、精密度

按1.3.4 的工作條件，對基質匹配標準曲線（10 ng·mL-1、25 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1）進 行 測定，以定量離子峰的峰面積為縱坐標，對應的標準曲線點質量濃度（ng·mL-1）為橫坐標繪制標準曲線，校正方程為y=480.078 2x-9 826.133 08，回歸相關系數r＞0.998。通過對空白基質連續添加標準品進行測定，直到定量離子m/z=44.1 的SIM 峰值的信噪比達到3 ∶1 及10 ∶1 來確定方法的檢出限和定量限。方法的檢出限為0.1 mg·kg-1，定量限為0.3 mg·kg-1。《出口罐頭食品中尿素殘留量的測定》（SN/T 1004—2013）[10]規定尿素定量限為1 mg·kg-1，本方法的定量限低于行業標準方法。用質量濃度為20 ng·mL-1的標準工作液，進行重復測定6 次，該方法的RSD（n=6）為3.4%。實驗表明本方法的線性、重復性、檢出限滿足《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）[11]的相關要求。

2.4 回收率實驗

將適量尿素標準工作溶液添加到空白樣品，進行1 mg·kg-1、5 mg·kg-1、10 mg·kg-13 個 水 平（n=6）加標回收試驗，平均回收率為86.1%～97.1%，方法的相對標準偏差為2.6%～6.5%，結果表明方法具有較高的精密度及重現性。

2.5 樣品測定

通過該方法對自培及農貿采購的32 批豆芽菜樣品進行測定分析，結果見表2。從表2 中可以看出所有樣品均有檢出尿素，使用SPSS 對自主栽培及農貿采購的豆芽樣品中尿素的測定結果進行單因素方差分析，發現自培及農貿采購兩組樣品之間的尿素含量沒有顯著性差異（P=0.664）。

表2 兩組樣品中尿素的檢測結果

3 結論

本研究通過優化樣品提取凈化條件和分離條件，建立了UPLC-MS/MS 法測定豆芽中尿素的方法。該方法前處理簡單，具有較好的準確度和靈敏性，定量限優于現行有效的行業標準。運用該方法對自培、農貿市場豆芽樣品進行測定，結果顯示所有的樣品均有檢出尿素，經方差分析，自培及農貿采購兩組樣品之間的尿素含量沒有顯著性差異（P=0.664）。豆芽中的尿素有可能與豆芽生長發育過程中的內源性蛋白質代謝有關[12]，這有待進一步的研究以確定豆芽中尿素含量的本底值，為豆芽生產監管提供科學的依據。