同位素內標-超高效液相色譜-串聯質譜測定肉類中17 種全氟化合物

2022-03-23 08:18:22林永濤謝燕湘曾小元李兆敏黃開慧

食品安全導刊 2022年33期

林永濤，謝燕湘，曾小元，李兆敏，黃開慧

（常德市疾病預防控制中心，湖南常德 415000）

全氟化合物（Perfluorinated Compounds，PFCs）是一大類有機化合物中與碳原子相連的氫原子被氟原子完全替代的有機物的統稱，主要包括全氟烷基類、全氟羧酸、全氟磺酸、全氟磷酸等，因其結構中含有高鍵能的碳氟鍵，而化學性質穩定，能夠受強的紫外光照、加熱、化學和微生物作用，在自然環境中能長期存在難以降解[1-2]。PFCs 廣泛應用于阻燃劑、表面活性劑、催化劑、殺蟲劑和紡織品等諸多領域[3-4]。PFCs 具有神經毒性、免疫毒性、遺傳毒性、甲狀腺毒性等，研究表明，PFCs 通過各種途徑進入自然環境中，并能通過食物鏈累積[5-8]。肉類是人類必不可少的食物來源，食品中主要肉類來源的相關動物在食物鏈中處于中后端，使處于食物鏈頂端的人類食用相關肉類后存在的健康風險加大。目前肉類中PFCs 測定相關國標是《食品安全國家標準動物源性食品中全氟辛烷磺酸（PFOS）和全氟辛酸（PFOA）的測定》（GB 5009.253—2016），只測定其中兩種PFCs，沒有多種PFCs 的檢測方法，不能全面反映肉類中PFCs 污染情況，建立相關分析方法了解肉類食品中PFCs 的含量對食品安全標準的制定有一定參考意義[9-12]。同位素內標法是在樣品前處理過程中加入待測化合物的同位素內標物，利用待測物與對應的同位素內標物響應的比值來測定待測濃度的方法，彌補了外標法的一些不足，增強了分析結果的準確性和可靠性[13-16]。本實驗用同位素內標法，采用乙腈/水超聲萃取肉類中17 種PFCs，經固相萃取柱凈化分離，由UPLC-MS/MS 分析檢測，定量準確、靈敏度高，用于實際肉類樣品中PFCs的分析測定，獲得了滿意的結果，為肉類質量安全檢測及相關標準制定提供了技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯質譜儀，配Turbo V 電噴霧離子源（QTRAP 4500，美國AB SCIEX 公司）；Analyst 1.7.2 數據處理系統（美國AB SCIEX 公司）；ExionLC 超高效液相（日本島津公司）；色譜柱：Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，飛諾美公司）；Milli-Q Ultrapuer Water 超純水自動制水系統（美國密理博公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ-250DE 型數控超聲萃取器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；NP-30S 渦旋樣品混勻器（常州市恩培儀器制造公司）；QSJ-C04B1 小熊樣品粉碎機（佛山小熊電器股份有限公司）；1.0 mL 和 5.0 mL Eppendorf 手動移液槍（德國Eppendorf 股份公司）；湘儀TGL-20M 臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；針式過濾器：0.22 μm孔徑尼龍濾膜（津騰公司）；氣源：氮氣發生器（Peak公司）；固相萃取柱：Captiva EMR-Lipid，3 mL，300 mg（Agilent 公司）。

17 種全氟化合物混合標準品：購自天津阿爾塔科技有限公司，濃度為100 μg·mL-1，溶劑為乙腈；9 種全氟化合物的18O 取代或13C 取代同位素混合內標溶液：美國Wellingtons Lab 產品，9 種同位素混合內標溶液的濃度是2 000 ng·mL-1，混合標準溶液溶劑是甲醇。實驗用17 種全氟化合物混合標準溶液里面包含13 種全氟取代烷基羧酸和4 種全氟取代烷基磺酸鹽，它們分別是全氟丁烷羧酸（PFBA）、全氟戊烷羧酸（PFPeA）、全氟己烷羧酸（PFHxA）、全氟庚烷羧酸（PFHpA）、全氟辛烷羧酸（PFOA）、全氟壬烷羧酸（PFNA）、全氟癸烷羧酸（PFDA）、全氟十一烷羧酸（PFUdA）、全氟十二烷羧酸（PFDoA）、全氟十三烷羧酸（PFTrDA）、全氟十四烷羧酸（PFTeDA）、全氟十六烷羧酸（PFHxDA）、全氟十八烷羧酸（PFODA）、全氟丁烷磺酸鉀（PFBS）、全氟己烷磺酸鈉（PFHxS）、全氟辛烷磺酸鉀（PFOS）和全氟癸烷磺酸鈉（PFDS）。9 種全氟化合物內標溶液中含有7 種全氟烷基羧酸13C 取代內標和2 種全氟烷基磺酸鹽18O 取代內標，它們分別是全氟丁烷羧酸內標（13C4-PFBA）、全氟己烷羧酸內標（13C2-PFHxA）、全氟辛烷羧酸內標（13C4-PFOA）、全氟壬烷羧酸內標（13C5-PFNA）、全氟癸烷羧酸內標（13C2-PFDA）、全氟十一烷羧酸內標（13C2-PFUdA）、全氟十二烷羧酸內標（13C4-PFDoA）、全氟己烷磺酸鈉內標（18O2-PFHxS）和全氟辛烷磺酸鉀（13C4-PFOS）。

甲醇（質譜級，德國Merk 公司）；甲酸（質譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲酸銨（質譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙腈（質譜級，德國Merk 公司）。

1.2 儀器條件

（1）色譜條件。流動相A：濃度為2 mmol·L-1甲酸銨水溶液；流動相B：純甲醇；流速： 0.30 mL·min-1；色譜柱溫：40 ℃；樣品進樣體積：10 μL；梯度洗脫程序：0 ～2 min 時，流動相A、B分別為60%和40%，2 ～7 min 時流動相A、B 分別為5%和95%，7 ～10 min 流動相A、B 分別為60%和40%。

（2）質譜條件。Turbo V 電噴霧離子源（ESI）；串聯質譜檢測模式：多反應離子監測（MRM）；質譜離子化電壓：-4 500 V；離子源溫度：555 ℃；氣簾氣的氣體壓力：37 psi；碰撞氣流速：中等；霧化氣氣體壓力：51 psi；輔助氣氣體壓力：51 psi；駐留時間：16 ms。

1.3 標準溶液配制

用甲醇將17 種混合標準溶液和9 種同位素混合內標溶液分別配制成濃度為200 ng·mL-1使用液， 4 ℃保存。用甲醇/水溶液（40/60）將17 種混合標準溶液逐級稀釋為濃度0.2 ng·mL-1、0.4 ng·mL-1、 0.8 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、1.5 ng·mL-1和2.0 ng·mL-1混合標準點組成的標準系列溶液，每個標準點中全氟化合物的定量內標物濃度均為1.0 ng·mL-1。

1.4 樣品采集與處理

肉類樣品采自市區各大菜市場和超市。準確稱取樣品2 g（精確至0.00 01 g）置于15 mL 聚丙烯具塞離心管中，加入100 μL 全氟化合物同位素內標稀釋使用液（200 ng·mL-1），準確加入2.0 mL 超純水，渦旋振蕩3 min，加入色譜純8.0 mL 乙腈，超聲萃取30 min，10 000 r·min-1常溫離心10 min，取上清液3.0 mL 過固相萃取柱，棄去約1 mL 流出液，過0.22 μm 有機濾膜，取過濾液0.5 mL加超純水0.5 mL 混勻，供UPLC-MS/MS 測定。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

不同的流動相組成對樣品的分離起重要作用，考察了以0.1%甲酸水/甲醇、0.1%甲酸水/乙腈、2 mmol·L-1甲酸銨水/ 甲醇和2 mmol·L-1甲酸銨水/乙腈為流動相時，17 種全氟化合物在等度洗脫和梯度洗脫條件下的響應及分離效果。結果表明，以2 mmol·L-1甲酸銨水/甲醇為流動相進行梯度洗脫時17 種全氟化合物可以較好地分離。色譜柱同樣影響樣品的分離，比較了Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）和ACQUITY UPLC BEH Shield RP18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）兩種類型的色譜柱對17種全氟化合物的分離情況，結果顯示兩種色譜柱都能實現較好的分離，Kinetex C18柱分離效果更佳，峰形更對稱，且能夠在10 min 內分離17 種全氟化合物，ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 柱需要15 min 以上，為提高分析效率，采用Kinetex C18柱進行分析。

2.2 質譜條件優化

配制濃度為100 μg·L-1的17 種全氟化合物和9種內標物的使用液，選擇ESI（-）電離模式，用針泵進樣，在質譜模式下，對各化合物進行全掃描，獲得每種氟化物的母離子信息，再經質譜子離子掃描，得到每種氟化物的子離子信息，根據每種離子豐度比選擇相應的定量、定性離子對，并對每種氟化物的去簇電壓和碰撞能量參數進行優化，從而得到最優MRM 模式下質譜的檢測條件。17 種全氟化合物和9 種內標物的MRM 質譜采集參數見表1。在優化好的條件下進行測定，1.0 ng·mL-117 種全氟化合物和9 種內標物的總離子流圖如圖1 所示。

表1 17 種全氟化合物和9 種內標物的MRM 模式質譜優化參數

圖1 17 種全氟化合物和9 種內標物的總離子流圖（1.0 ng·mL-1）

2.3 線性范圍、檢出限、定量限、精密度和回收率

按照優化的儀器條件，由低濃度的標準溶液到高濃度的標準溶液依次進行測定。以待測物和與之對應內標物的濃度比值作為橫坐標，以待測物的峰面積和與之對應內標物峰面積的比值作為縱坐標，繪制標準曲線，17 種全氟化合物在0.2 ～2.0 ng·mL-1線性關系良好，相關系數r均≥0.993。采用空白基質進行加標實驗以3 倍信噪比（S/N=3）估算待測物的檢出限，以10 倍信噪比（S/N=10）估算待測物的定量限，以2 g 樣品經處理后定容至1 mL 計，17 種全氟化合物的標準曲線、相關系數、定量限及檢出限見表2。分別準確稱取2 g（精確至0.000 1 g）未檢出全氟化合物的肉類樣品豬肉和魚肉各一份添加 100 μL 濃度為200 ng·mL-1的17 種全氟化合物標準溶液，與實際樣品一樣前處理后進樣，連續進樣6 次，其回收率及其相對偏差（RSD）見表2。