酶底物法測定中山城市供水中的腸球菌

馮飛燕，于曉君，龔 晉，吳佳萍

（中山公用水質檢測有限公司，廣東中山 528403）

腸球菌是新國標《生活飲用水衛生標準》 （GB 5749—2022）附錄A 參考指標。新國標刪除了耐熱大腸菌指標，改用埃希氏大腸菌作為糞性污染的指示菌，研究表明腸球菌也是一種優于總大腸菌的糞便污染指示物。

在細菌學分類上，腸球菌（Enterococcus）屬原歸屬于鏈球菌屬。腸球菌易污染食品以及生活和加工用水，易傳播疾病。此外，腸球菌具有天然耐藥和獲得性耐藥的特征，會使所致感染治療困難[1]。因此，腸球菌成為食品、水質、加工設備衛生和生產環境衛生狀況的評估指標。腸球菌的重要特點是在水中存活的時間比大腸桿菌長，對于氯的抵抗力更強。腸球菌可用于輸配水系統維修后或新管線鋪設后的水質檢測[2]。衛生學家認為加強原水中腸球菌的檢測有一定意義，在水廠出廠水及管網水的檢測中增加對腸球菌的監測，能進一步保障城市供水安全。

腸球菌的標準檢測方法通常有兩種，濾膜法[3]和酶底物法[4]，通過兩種方法對比，季婉菁[5]的結論是兩種方法均可對飲用水中腸球菌進行檢測，而采用酶底物法更簡便。褚福敏[6]發現酶底物法能大大降低假陽性和渾濁度、非腸球菌的干擾，更加準確可靠。山東省地方標準[7]用酶底物法測定飲用水和水源水的腸球菌，遼寧省地方標準[8]用酶底物法測定地表水、地下水、飲用水、海水和工業廢水中的腸球菌。本文采用酶底物法驗證其正確度和精密度，并應用于檢測原水、出廠水、管網水、二次供水，龍頭水，新管道水，老舊小區管網改造水，對腸球菌在供水全流程中進行風險識別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Enterolert腸球菌試劑，97孔定量盤，無菌采樣瓶：100 mL，封口機；恒溫培養箱：（41.0±0.5）℃；紫外燈：6 W，365 nm。

1.2 方法

1.2.1 方法原理

腸球菌利用特異性代謝產物β-葡萄糖苷酶分解培養基中的熒光指示劑4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷，釋放出熒光產物，使樣品在紫外光照射(41.0±0.5)℃，（24±2）h 下產生特征性熒光，以此來檢測樣品中的腸球菌。酶底物法所用試劑包中添加的成分可抑制高達200×104個/100 mL的異樣微生物，能避免非腸球細菌（如沙雷菌屬、克雷伯菌屬和綠色氣球菌屬）干擾而導致的測定結果誤差，Enterolert 固定底物酶底物營養指示劑檢測腸球菌，提高檢測的準確度。

1.2.2 樣品采集

檢測水樣來自中山西江流域磨刀門水道、小欖水道、雞鴨水道3 個水道7 個水源地，從北到南分別是磨刀門水道的GZ、QL，NL，小欖水道的DF、DS、D，雞鴨水道的N，還有3 個水庫水，分別是CJ、NT、LT。采樣頻率為每周1 次，連續3 周。

城市供水選取了城區主要3 個出廠水，樣品編號為CDF、CQL、CCJ，5 個管網水，樣品編號為G1 ～G5，5 個二次供水，樣品編號為E1 ～E5， 5 個龍頭水，樣品編號為L1 ～L5，4 個新管道水，樣品編號為X1 ～X4，3 個老舊小區管網改造水，樣品編號為J1 ～J3。

1.2.3 試驗步驟

①將100 mL 水樣倒入無菌采樣瓶中。②將一份EnterolertTM 測試包倒入裝有100 mL 水樣的無菌采樣瓶中。蓋上蓋子，搖勻，至完全溶解。③將瓶中水樣全部倒入97 孔定量盤中，用封口機封口。④將已封口的定量盤放在（41.0±0.5）℃培養箱中培養 （24±2）h。⑤培養24 h 后，取出定量盒，在暗室中使用6 W，365 nm 的紫外燈在距樣品15 cm 的位置處觀測是否顯示藍色熒光。顯示為藍色熒光的為腸球菌陽性，無熒光的為腸球菌陰性。計數陽性個數對照MPN 表得到定量檢測結果。

2 結果與分析

2.1 方法的正確度

采用上述方法測定質控樣，結果如表1。從陰陽性控制看，酶底物EnterolertTM 對大腸桿菌（陰性對照）與腸球菌（陽性標樣）反應合格。糞腸球菌質 控 真 值 為（1 813±332）MPN/100 mL，log 值 為（3.26±0.70），可 接 受 范 圍 為881 ～4 097 MPN/ 100 mL，兩次質控結果在可接受范圍內。兩次質控平均值為950.1 MPN/100 mL，log 值為2.98，相對誤差為8.6%，平行雙樣的重復性r=0.03，滿足食品微生物實驗室內平行雙樣重復性的要求r≤0.25[9]。

表1 酶底物法測定質控樣結果

2.2 方法的精密度

根據食品微生物實驗室7 和ISO 4833-1：2013[10]質控規定，使用相同方法，在同一實驗室檢測同一種物質，由同一操作者使用同一設備在短時間內的兩次獨立的單次試驗結果的絕對差值，不應大于重復性限r=0.25，以10 為底的每毫升中微生物計數的對數。表2 用實際水樣驗證方法的精密度，從重復性r判斷方法精密度（r=log10平行1－log10平行2），計數＞10 MPN/100 mL 的樣品平行雙樣r可達到質控要求，計數＜10 MPN/100 mL 的樣品難以達到質控要求。

2.3 地表水腸球菌的測定結果

選取中山市部分地表水，包括西江3 條水道7個供水水源地，3 個水庫水，利用酶底物法測定以上10 個地表水腸球菌，結果見表2。結果表明，西江源水腸球菌遠比水庫水高，中山用于供水水源的水庫遷移了村民，禁止工農業生產，因此受到糞便污染少；DS 源水腸球菌比其他水源地高很多，此水源地在中山供水規劃中將被取締。

表2 實際水樣測定腸球菌的精密度

糞（耐熱）大腸菌群（Thermotolerant coliforms）和腸球菌（Enterococcus）都是判斷污染來源的糞便污染指示物。表3 對比了中山市以上10 個地表水糞大腸菌群和腸球菌，當樣品檢測出糞大腸菌為陽性時，腸球菌也為陽性，定量結果腸球菌比糞大腸菌群小，這跟褚福敏[6]報道一致。糞大腸菌群是《地表水環境質量標準》（GB 3838—2002）唯一糞便污染指示菌。日益進步的微生物學、流行病學及統計學方法進一步證實，腸球菌是優于總大腸菌群和糞大腸菌群的糞便污染指示物[5]。我國2022 年3 月新發布的《生活飲用水衛生標準》（GB 5749—2022）采用更有衛生意義的指示菌——埃希氏大腸菌，刪除了耐熱大腸菌群，在附錄A 的參考指標中仍然保留腸球菌。

表3 中山市部分地表水糞性大腸菌和腸球菌對比

2.4 城市供水腸球菌的測定

城市供水選取了城區主要3 個出廠水CDF、CQL、CCJ，5 個管網水G1 ～G5，5 個二供泵 房E1 ～E5，5 個 龍 頭 水L1 ～L5，4 個 新 管 道 水X1 ～X4，3 個老舊小區管網改造水J1 ～J3。測定以上25 個水樣的余氯、總大腸菌群、腸球菌，結果見表4。當飲用水中有余氯存在下或經過余氯消毒，全流程節點總大腸菌和腸球菌都未檢出。

表4 城市供水全流程測定余氯、總大腸菌群、腸球菌

3 結論

本文驗證酶底物法測定水中腸球菌方法，對中山市有代表性的10 個水源地，25 個城市供水用酶底物法測定腸球菌，結論如下。

（1）酶底物法測定水中腸球菌質控平均值 950.1 MPN/100 mL，在可接受范圍881 ～4 907 MPN/ 100 mL。實際水樣測定腸球菌驗證方法精密度，得到測定值＞10 MPN/100 mL 的水樣，實驗室內重復性r≤0.25，滿足微生物質控要求。因此，酶底物法測定水中腸球菌方法準確、可靠。

（2）用酶底物法測定中山市地表水的10 個水源地樣品中的腸球菌，結果發現西江水比水庫腸球菌高。腸球菌與糞大腸菌定性一致，定量更小。

（3）用酶底物法測定中山城市供水全流程出廠水、管網水、二次供水、龍頭水、新管道水和老舊小區管網改造水的腸球菌，結果發現在有余氯存在下或經過余氯消毒，城市供水均未檢出，因此正常供水狀態下，腸球菌的風險主要在于源頭，城市供水其他環節的腸球菌風險低。