基于斑馬魚模型的黃鱔肽減肥作用研究

關天竹，何春艷，王 濤，張華萍

（廣東壹健康健康產業集團股份有限公司，廣東廣州 510385）

肥胖屬于慢性代謝性疾病，是遺傳和環境等共同作用的結果[1]。肥胖與很多疾病的發生有一定的相關性，包括心腦血管疾病、呼吸系統疾病、糖尿病、骨關節炎以及部分腫瘤等。此外，肥胖還會帶來嚴重的社會問題和心理問題。因此，預防肥胖及減肥已成為醫學界和大健康領域研究的熱點。

目前肥胖的干預手段主要包括全生活方式管理（膳食營養干預、體育運動、行為干預）、減肥藥物干預以及外科手術等。大多數減肥藥物副作用大、安全性不明確；而減肥外科手術又存在較大風險，因此膳食營養干預為主的全生活方式管理已成為國際公認最安全有效的體重管理策略。因而開發天然、安全性好，且具有明確減肥功效的食品原料用于肥胖人群的膳食營養干預，對預防肥胖及減肥具有重要的現實意義。

黃鱔，俗稱長魚、鱔魚和無鱗公子等，是我國重要的名優淡水魚類之一，在長江以南的湖北、四川、湖南等省份分布最為廣泛[2-3]。黃鱔中蛋白質含量高達19%，脂肪低于1%，屬于高蛋白低脂肪食品，且黃鱔蛋白質氨基酸種類齊全，具有很高的營養價值[4]。黃鱔肽是黃鱔的肉、骨等經酶解、超濾、滅菌、噴霧干燥等工藝制備而成的食品原料，其中分子量＜ 1 000 Da 的肽段約80%。已有研究表明，食源性活性肽可通過抑制脂肪吸收、促進脂肪代謝，從而起到降脂減肥的效果[5-7]。

基于肽類食品原料具有良好的減肥作用，本研究以黃鱔肽為研究對象，通過建立斑馬魚脂肪代謝和脂肪吸收模型，評價黃鱔肽促進脂肪分解和抑制脂肪吸收的作用，以期為黃鱔肽減肥及預防肥胖產品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 受試樣品及其配制

黃鱔肽，批號20220701，廣東壹健康健康產業集團股份有限公司；用超純水配制成20.0 mg·mL-1母液，4 ℃儲存。白藜蘆醇，批號F2121344，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；用二甲基亞砜配制成11.4 mg·mL-1母液，-20 ℃分裝儲存。奧利司他，批號085220301，山東新時代藥業有限公司；用二甲基亞砜配制成15.0 mg·mL-1母液，4 ℃儲存。

1.2 實驗動物

實驗用斑馬魚選擇黑色素等位基因突變型Albino 品系，通過自然成對交配的方式繁殖斑馬魚胚胎。受精后第2 天（2 dpf）斑馬魚幼魚用于黃鱔肽促進脂肪分解功效最大耐受濃度測定及其功效評價；受精后第5 天（5 dpf）斑馬魚幼魚用于黃鱔肽抑制脂肪吸收功效最大耐受濃度測定及其功效評價。

斑馬魚飼養溫度：28 ℃；飼養水質：速溶海鹽含量為200 mg·L-1，電導率為450 ～550 μS·cm-1，pH 值為6.5 ～8.5，硬度為50 ～100 mg·L-1（CaCO3）。

1.3 儀器與試劑

解剖顯微鏡（SZX7，奧林巴斯，日本）；CCD相機（VertA1，上海土森視覺科技有限公司）；精密電子天平（CP214，奧豪斯，美國）；6 孔板（無錫耐思生命科技股份有限公司）；電動聚焦連續變倍熒光顯微鏡（AZ100，尼康，日本）。

純蛋黃粉（批號20200809，浙江艾格生物科技股份有限公司）；D-（+）-葡萄糖（批號L2108079，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二甲基亞砜（批號BCCD8942，西格瑪，美國）；甲基纖維素（批號C2004046，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；4%組織細胞固定液（批號20210828，北京索萊寶有限公司）；尼羅紅（批號SLBP9326V，西格瑪，美國）；油紅O（Oil Red O，批號SHBN4926，西格瑪，美國）；1,2-丙二醇（批號20211117，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 黃鱔肽促進脂肪分解功效最大耐受濃度（MTC）測定

將180 尾2 dpf 斑馬魚分為6 組，分別置于6孔板中，每孔處理30 尾斑馬魚。正常對照組給予 3 mL 養魚用水，黃鱔肽實驗組分別給予3 mL 濃度為 62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1、250.0 μg·mL-1、500.0 μg·mL-1和1 000.0 μg·mL-1黃鱔肽。28 ℃處理至4 dpf，測定正常斑馬魚對黃鱔肽的最大耐受濃度。

1.4.2 黃鱔肽促進脂肪分解功效評價

將150 尾2 dpf 斑馬魚分為5 組，分別置于6孔板中，每孔處理30 尾斑馬魚。正常對照組給予 3 mL 養魚用水，陽性對照組給予濃度為11.4 μg·mL-1的白藜蘆醇，黃鱔肽實驗組分別給予3 mL 濃度為 31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1和125.0 μg·mL-1的黃鱔肽。各組處理24 h 后，均水溶給予尼羅紅染料。繼續處理至4 dpf，從黃鱔肽實驗組、正常對照組和陽性對照組中均隨機選取10 尾斑馬魚，在熒光顯微鏡下觀察熒光標記并拍照，用圖像處理軟件分析，計算斑馬魚卵黃囊脂肪熒光強度，以該指標評價黃鱔肽對斑馬魚脂肪分解的促進作用。

1.4.3 黃鱔肽抑制脂肪吸收功效最大耐受濃度（MTC）測定

將210 尾5 dpf 斑馬魚分為7 組，分別置于燒杯中，每個燒杯處理30 尾斑馬魚。正常對照組和模型對照組分別給予20 mL 養魚用水，黃鱔肽實驗組分別給予20 mL 濃度為31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、 125.0 μg·mL-1、250.0 μg·mL-1、500.0 μg·mL-1的黃鱔肽。各組28 ℃處理1 h 后，除正常對照組外，模型組和黃鱔肽實驗組均水溶飼喂純蛋黃粉，建立脂肪吸收模型。28 ℃繼續處理24 h 后，測定黃鱔肽對模型斑馬魚的最大耐受濃度。

1.4.4 黃鱔肽抑制脂肪吸收功效評價

將180 尾5 dpf 斑馬魚分為6 組，分別置于燒杯中，每個燒杯處理30 尾斑馬魚。正常對照組和模型對照組分別給予20 mL 養魚用水，陽性對照組給予15.0 μg·mL-1奧利司他，黃鱔肽實驗組分別給 予20 mL 濃 度 為31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、 125.0 μg·mL-1的黃鱔肽。各組28 ℃處理1 h 后，除正常對照組外，模型對照組、陽性對照組和黃鱔肽實驗組均水溶飼喂純蛋黃粉，建立脂肪吸收模型。造模后，各組繼續飼養24 h 后，采用油紅O 進行斑馬魚脂肪染色。染色結束后，黃鱔肽實驗組、正常對照組、模型對照組和陽性對照組均隨機選取10 尾斑馬魚，置于解剖顯微鏡下觀察并拍照，經圖像處理軟件分析及采集數據，計算腸道和尾部血管脂肪染色強度，以該指標評價黃鱔肽對斑馬魚抑制脂肪吸收的 作用。

1.4.5 數據分析

實驗結果均采用mean±SE 表示，用SPSS 26.0軟件進行統計學分析，P＜0.05 表明差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 黃鱔肽促進脂肪分解功效最大耐受濃度（MTC）

由表1 可知，在62.5 ～125.0 μg·mL-1，黃鱔肽對斑馬魚未產生任何毒副作用，也未引起斑馬魚死亡，斑馬魚表型與正常對照組狀態相似；黃鱔肽濃度在250.0 ～1 000.0 μg·mL-1，斑馬魚死亡率均為100%。因此黃鱔肽最大耐受濃度為125.0 μg·mL-1，選 擇31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1的黃鱔肽濃度用于后續的實驗。

表1 黃鱔肽促進脂肪分解功效濃度摸索實驗結果（n=30）

2.2 黃鱔肽促進脂肪分解功效評價結果

黃鱔肽促進脂肪分解功效評價實驗結果如表2、圖1 所示。與正常對照組相比，黃鱔肽中、高劑量組卵黃囊脂肪熒光信號強度明顯降低（P＜0.01），表明在62.5 μg·mL-1和125.0 μg·mL-1濃度下，黃鱔肽具有促進斑馬魚脂肪分解功效。

表2 黃鱔肽促進脂肪分解功效評價實驗結果（n=10）

圖1 黃鱔肽處理后斑馬魚卵黃囊脂肪熒光強度典型圖

2.3 黃鱔肽抑制脂肪吸收功效最大耐受濃度（MTC）

由 表3 可 知，黃 鱔 肽 在31.2 ～125.0 μg·mL-1對斑馬魚未產生任何毒副作用，也未引起斑馬魚死亡，斑馬魚表型與模型對照組狀態相似；黃鱔肽在 250.0 μg·mL-1雖未引起斑馬魚死亡，但斑馬魚表型較模型對照組狀態嚴重；黃鱔肽在500.0 μg·mL-1時，斑馬魚死亡率為80%。因此在該模型下，黃鱔肽最大 耐 受 濃 度 為125.0 μg·mL-1，選 擇31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1的黃鱔肽濃度進行后續實驗。

表3 黃鱔肽抑制脂肪吸收功效濃度摸索實驗結果（n=30）

2.4 黃鱔肽抑制脂肪吸收功效評價結果

黃鱔肽抑制脂肪吸收功效評價實驗結果如表4、圖2 所示。相較于模型對照組，黃鱔肽高劑量組 （125.0 μg·mL-1）腸道和尾部血管脂肪染色信號強度明顯降低（P＜0.05），表明在125.0 μg·mL-1濃度下，黃鱔肽具有顯著的抑制斑馬魚脂肪吸收功效。

表4 黃鱔肽抑制脂肪吸收功效評價實驗結果（n=10）

圖2 黃鱔肽處理后斑馬魚腸道和尾部血管脂肪染色強度典型圖

3 結論

本文通過斑馬魚實驗驗證了黃鱔肽具有抑制脂肪吸收、促進脂肪分解的作用。該研究結果為黃鱔肽的市場應用提供了一定的理論依據，未來可廣泛應用于預防肥胖及減肥的功能食品及保健食品的開發。