RNF181、cyclin D1、Ki-67在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

梁伊靈 付星瑋 李曉波 薄威 張忠 黃波 王旭光 王柏芳 張珉

【摘要】 目的：研究環指蛋白181（ring finger protein 181，RNF181）、cyclin D1、Ki-67在非小細胞肺癌（NSCLC）組織中的表達水平及其臨床病理學意義。方法：采用免疫組織化學染色法檢測83例NSCLC組織及癌旁組織中RNF181、cyclin D1、Ki-67的蛋白表達情況并分析其臨床病理意義。結果：在NSCLC組織中RNF181主要定位于細胞漿，在肺癌組織中普遍低表達;cyclin D1、Ki-67主要定位于細胞核，在癌組織中相對高表達。不同腫瘤分化患者NSCLC組織中RNF181表達、cyclin D1陽性、Ki-67表達情況比較，差異均有統計學意義（P<0.05）;不同局部淋巴結轉移患者NSCLC組織中RNF181表達、cyclin D1陽性情況比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。不同年齡、性別、病理類型患者NSCLC組織中RNF181表達、cyclin D1陽性、Ki-67表達情況及不同局部淋巴結轉移患者NSCLC組織中Ki-67表達情況比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。NSCLC組織中RNF181表達與cyclin D1、Ki-67均呈負相關（rs=-0.373、-0.417，P<0.001），cyclin D1與Ki-67表達水平呈正相關（rs=0.526，P<0.001）。結論：RNF181在NSCLC組織中低表達，cyclin D1、Ki-67在NSCLC組織中高表達分別與腫瘤進展相關，并隨腫瘤分化程度或局部淋巴結轉移情況不同而存在差異，三者蛋白表達水平存在相關性。

【關鍵詞】 RNF181 cyclin D1 Ki-67 非小細胞肺癌 腫瘤進展

[Abstract] Objective： To study the expression levels and clinicpathological significance of ring finger protein 181 （RNF181）， cyclinD1 and Ki-67 in non-small cell lung cancer （NSCLC）. Method： Immunohistochemical staining was used to detect the expression of RNF181， cyclin D1 and Ki-67 in 83 cases of NSCLC and adjacent cancer tissues， and their clinicopathological significance was analyzed. Result： In NSCLC tissues， RNF181 was mainly located in the cytoplasm and generally low expression in lung cancer tissues; cyclin D1 and Ki-67?were mainly located in the nucleus and relatively high expression in cancer tissues. There were significant differences in the expression of RNF181， cyclin D1 and Ki-67 in NSCLC tissues of patients with different tumor differentiation （P<0.05）; there were significant differences in the expression of RNF181 and cyclin D1 in NSCLC tissues of patients with different local lymph node metastasis （P<0.05）. There were no significant differences in RNF181 expression， cyclin D1 positive expression and Ki-67 expression in NSCLC tissues of patients with different age， sex and pathological classification and Ki-67 expression in NSCLC tissues of patients with different local lymph node metastasis （P>0.05）. The expression of RNF181 in NSCLC was negatively correlated with cyclin D1 and Ki-67 （rs=-0.373， -0.417， P<0.001）， cyclin D1 was positively correlation with Ki-67 expression （rs=0.526， P<0.001）. Conclusion： The low expression of RNF181 in NSCLC tissues， the high expression of cyclin D1 and Ki-67 in NSCLC tissues are respectively related to tumor progression， they vary with the degree of tumor differentiation and local lymph node metastasis， and the expression levels of these three proteins are correlated.

[Key words] RNF181 cyclin D1 Ki-67 Non-small cell lung cancer Tumor progression

First-author’s address： Basic Medical College of Shenyang Medical College， Shenyang 110034， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.03.009

肺癌是常見的惡性腫瘤，據統計僅在2018年就有約209萬新發病例，且約有176萬人死于肺癌，占癌癥總死亡人數的五分之一[1-3]。其中80%都屬于非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），由于篩查方案不足和臨床癥狀出現較晚，大多數患者診斷時已為晚期疾病，因此患者預后通常很差[4-6]。為此，尋找調控NSCLC進展的關鍵分子，明確其分子機制，將有利于肺癌的早期診斷及靶向治療，從而降低病死率。

環指蛋白181（ring finger protein 181，RNF181）基因包含716個堿基，編碼153個氨基酸，其在胚胎發育過程中及胰腺、肝臟、腎臟等25種組織中均有表達[7-8]?，F已發現RNF181在多種腫瘤組織中表達，但其對腫瘤進展的調控作用尚不十分明確，且存在爭議[9-13]，尤其在NSCLC組織中的表達情況及臨床病理意義尚無報道。G1/S-特異性周期蛋白D1（cyclin D1）、增殖標志物Ki-67（Marker of Proliferation Ki-67，Ki-67）在NSCLC等多種腫瘤組織中高表達[14-15]，并與腫瘤進展過程密切相關。本研究旨在通過檢測NSCLC組織中RNF181、cyclin D1及Ki-67的表達情況，分析這三種蛋白表達的臨床病理意義及相互關系，探討它們在腫瘤進展過程中發揮的作用?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年6月-2020年12月遼寧省腫瘤醫院經病理診斷確診的83例NSCLC標本，其中男54例，女29例;年齡39～87歲，平均（60.23±8.36）歲;肺鱗癌29例，肺腺癌54例;出現局部淋巴結轉移45例。以上所有病例手術前均未接受任何放射治療及化學藥物治療。本研究已經沈陽醫學院醫學倫理委員會批準。

1.2 免疫組織化學染色

1.2.1 主要試劑 PBS磷酸鹽緩沖液（pH值7.2～7.6）、抗原修復緩沖液（檸檬酸法，pH值6.0）、內源性過氧化物酶阻斷劑、非免疫山羊血清封閉液、即用型免疫組化EliVision plus試劑盒（鼠/兔）、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒等均購于福州邁新生物技術開發有限公司，RNF181（F-2）單克隆抗體（鼠抗人）、cyclin D1（A-12）單克隆抗體（鼠抗人）、Ki-67（Ki-67）單克隆抗體（鼠抗人）均購于美國Santacruz公司。

1.2.2 方法 NSCLC組織標本經10%中性福爾馬林固定后，進行石蠟包埋，制作成厚度為4 μm的組織切片，所有切片均在統一條件下進行后續實驗，操作方法如下：（1）切片放入二甲苯及梯度酒精脫蠟水化;（2）加入檸檬酸鈉（pH值6.0）抗原修復液，通過高壓熱修復法進行抗原修復;（3）經PBS洗滌后滴加過氧化物酶阻斷劑，濕盒放入30 ℃孵箱中恒溫孵育20 min;（4）PBS洗滌后，滴加非免疫山羊血清進行抗原封閉;（5）滴加一抗：RNF181（1∶650），cyclin D1（1∶150），Ki-67（1∶200），經4 ℃過夜孵育，同時采用PBS代替一抗作為空白對照;（6）滴加EliVision plus試劑盒中反應增強液，恒溫30 ℃孵育20 min;（7）PBS洗滌后，滴加酶標抗小鼠/兔IgG聚合物，30 ℃恒溫孵育28 min，再次PBS洗滌;（8）二氨基聯苯胺DAB結合辣根過氧化物酶顯色;（9）蘇木素復染細胞核;（10）脫水、透明、封片、鏡檢。

1.2.3 結果判定標準

1.2.3.1 RNF181 在每張RNF181免疫組織化學染色切片中，隨機選取10個視野（×400），并隨機計數200個細胞，進行陽性結果判定。RNF181定位于細胞漿，根據染色強度，無顏色變化為0分，淺黃色為1分，棕色為2分，深棕褐色為3分;根據染色范圍：陽性細胞數<10%為0分，10%～25%為1分，26%～75%為3分，76%～100%為4分。兩項評分相乘為最終評分（0～12分），<6分為RNF181低表達，6～12分為RNF181高表達。

1.2.3.2 cyclin D1 cyclin D1主要定位于細胞核，陽性表達為棕色或黃色顆粒，在高倍鏡下進行觀察，隨機選取10個視野（×400），并隨機計數200個細胞，按照陽性細胞所占比例進行評分，核著色陽性率大于5%為cyclin D1陽性，反之記為cyclin D1陰性。

1.2.3.3 Ki-67 Ki-67定位于細胞核，陽性表達為棕色或黃色顆粒。在高倍鏡下進行觀察，隨機選取10個視野（×400），并隨機計數200個細胞，按照陽性細胞所占比例進行評分，小于30%記為Ki-67低表達，30%及以上記為Ki-67高表達。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 8軟件進行統計分析，計量資料用（x±s）表示;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗;相關性分析采用Spearman相關性分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RNF181、cyclin D1、Ki-67在NSCLC組織中的表達 83例NSCLC組織中，RNF181主要定位于細胞漿，見圖1A、1B，其中42例（51%）為低表達，RNF181在癌旁肺組織中呈中高表達;cyclin D1主要定位于細胞核，見圖1C、1D。cyclin D1陽性主要出現在NSCLC組織中，癌旁肺組織普遍呈陰性表達;Ki-67主要定位于細胞核，見圖1E、1F。Ki-67陽性主要出現在NSCLC組織中，癌旁肺組織普遍呈陰性或低表達。PBS空白對照見圖1G。不同腫瘤分化患者NSCLC組織中RNF181表達、cyclin D1陽性、Ki-67表達情況比較，差異均有統計學意義（P<0.05）;不同局部淋巴結轉移患者NSCLC組織中RNF181表達、cyclin D1陽性情況比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。不同年齡、性別、病理類型患者NSCLC組織中RNF181表達、cyclin D1陽性、Ki-67表達情況及不同局部淋巴結轉移患者NSCLC組織中Ki-67表達情況比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1、2、3。

2.2 NSCLC組織中RNF181、cyclin D1、Ki-67蛋白表達水平相關性分析 對RNF181、cyclin D1及Ki-67在NSCLC組織中的蛋白表達水平進行Spearman相關性分析，發現RNF181表達與cyclin D1及Ki-67表達均呈負相關（rs=-0.373，-0.417，P<0.001），cyclin D1表達與Ki-67表達呈正相關（rs=0.526，P<0.001）。

3 討論

RNF181（RING finger protein 181）又稱為HSPC238，基因定位于染色體2p11.2[8]，其基因組含有153個氨基酸編碼716個堿基[16]，分子質量18kDa，屬于環指蛋白超家族，具有RING型結構域[17]，在多種組織中都有表達?，F有的研究發現，RNF181可能通過整聯蛋白aⅡbβ3（Integrin aⅡbβ3）或泛素-蛋白酶等途徑發揮各種復雜的調控作用[18]。本研究發現，RNF181蛋白主要定位于細胞漿中，不同局部淋巴結轉移、腫瘤分化患者NSCLC組織中RNF181表達比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。這提示RNF181可能對NSCLC進展發揮抑制作用。應當指出，RNF181對腫瘤進展的調控作用尚不十分明確，相關報道亦存在矛盾之處。與本研究發現相似，有研究報道了RNF181在彌漫大B細胞淋巴瘤、肝癌、胃癌、乳腺浸潤性導管癌中低表達并與腫瘤進展及不良預后相關[9-10，19-23]。與之相反，部分基于腸癌及三陰性乳腺癌的研究發現這些腫瘤中RNF181的蛋白表達水平均高于正常組織，并可通過調控Hippo信號通路或ERα對腫瘤進展發揮促進作用[12-13，24-25]。上述看似矛盾的研究結果提示：在不同腫瘤組織中，由于RNF181上、下游分子表達及活化水平不同，可能進一步影響到RNF181的表達及其對腫瘤進展的調控作用，其具體分子機制尚需進一步深入研究。

Ki-67主要表達于細胞核內，是全面反映細胞增殖活性的可靠指標。其功能與細胞的有絲分裂及細胞周期相關[26-27]。Ki-67在細胞增殖周期中除G0期外的各期中均有表達，且在細胞增殖結束后會迅速降解，是目前被廣泛應用于檢測細胞增殖狀態的標記物之一[28-31]?，F有研究發現Ki-67高表達與包括肺癌在內的多種惡性腫瘤的分化程度、臨床病理分期、局部淋巴結轉移及不良預后等指標相關[14]，提示Ki-67的表達情況是反映腫瘤進展的重要指標。本研究亦發現：不同腫瘤分化患者NSCLC組織中Ki-67表達情況比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。這與現有研究發現相吻合，提示其可對NSCLC進展發揮促進作用。

cyclin D1為細胞周期相關蛋白，為細胞周期的啟動因子，也是生長感受器[15]。cyclin D1可與CDK4等蛋白結合，激活CDK激酶活性，促進細胞從G1到S期轉換，加速細胞增殖[32]。此外，cyclin D1還可通過調控細胞侵襲能力促進腫瘤轉移[33-34]。cyclin D1常在肺癌中高表達，且與腫瘤pTNM分期、局部淋巴結轉移及不良預后等臨床病理指標相關[35-39]。本研究亦發現，不同腫瘤分化、局部淋巴結轉移患者NSCLC組織中cyclin D1陽性情況比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。提示其可對NSCLC進展發揮促進作用。

本研究發現在NSCLC組織中，RNF181表達與cyclin D1、Ki-67表達均呈負相關（P<0.001），而cyclin D1表達與Ki-67表達呈正相關（P<0.001）?，F有腫瘤研究對上述三種分子表達相關性的報道不盡相同，與本的研究發現類似，Wang等[11]研究發現胃癌組織中RNF181、cyclin D1表達水平負相關，RNF181通過ERK/MAPK/cyclin D1/CDK4通路抑制胃癌進展。有研究報道乳腺癌組織中cyclin D1、Ki-67表達水平呈正相關[40]，而鱗狀上皮腫瘤中，因P16表達情況不同，cyclin D1及Ki-67的表達可分別呈負相關或正相關[41-42]。上訴研究結果提示：受到多種上、下游分子的影響，RNF181、cyclin D1及Ki-67之間可能存在復雜的交互作用，并進一步調控腫瘤的進展過程。

綜上所述，RNF181在NSCLC組織中相對低表達，cyclin D1、Ki-67在NSCLC組織中相對高表達，三者表達水平存在相關性，并隨腫瘤分化程度或局部淋巴結轉移情況不同而存在差異，其各自或協同對腫瘤進展的調控作用及分子機制尚需進一步深入研究。

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（收稿日期：2021-04-22） （本文編輯：程旭然）