共同性外斜視患兒眼外肌中IGF-1、AnxA1表達及與病理特征的關系

李 威，侯文文，李 影，章志揚

共同性外斜視是眼科常見斜視類型，危害大，發病率高，影響雙眼視覺形成及發育，是引起兒童雙眼視功能障礙的重要原因，同時有礙外觀，影響患者身心健康[1]。共同性外斜視發病機制復雜，多認為與先天及解剖因素等有關[2]。既往研究多集中于眼外肌病理改變方面，包括眼外肌本體感受器、組織間質成分改變等[3]。最新研究發現，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)可調控蛋白肌酶信號傳導，影響肌衛星細胞增殖、分化，促進肌纖維蛋白合成，修復肌細胞損傷[4]。動物研究認為，外源性補充眼外肌IGF-1可擴大肌纖維橫截面積，提升肌肉收縮力[5]。LEIKINA等[6]報道，肌衛星細胞靜止、活化期均可出現膜聯蛋白A1(AnxA1)表達，促進肌衛星細胞遷移，并參與骨骼肌修復過程。推測IGF-1、AnxA1均可能通過調節眼外肌活化肌衛星細胞等途徑影響眼外肌組織特性及生物學功能。為探究共同性外斜視眼外肌IGF-1、AnxA1表達情況及其與病理特征的關系，本研究檢測共同性外斜視與非共同性外斜視患者眼外肌IGF-1、AnxA1表達情況，并探討其與病理特征的關系，以期為共同性外斜視病理機制的研究提供參考。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2016年1月—2019年12月我院收治的共同性外斜視患兒53例(82眼)作為斜視組。納入標準：年齡3～14歲；符合共同性外斜視診斷標準[7]；有手術指征，至少接受一條內直肌縮短術治療；留存內直肌標本；無眼球運動障礙；第一、二斜視角相同；斜視度50～140△；臨床資料完善。排除標準：有眼部外傷史、手術史者；有家族遺傳史者；內直肌麻痹者；合并神經系統疾病者；顱面異常者；伴其他視覺缺陷疾病或眼病者；嚴重屈光不正、重度弱視或屈光參差者；伴其他器質性病變者；已接受斜視矯正者。斜視組男23例(32眼)、女30例(50眼)；年齡3～14(7.12±2.21)歲；病程1～6(3.76±1.21)年；斜視度(83.51±15.57)△。另選取同期行眼球摘除或角膜移植獲得內直肌的正常眼位患兒30例(30眼)作為對照組，其中男12例(12眼)、女18例(18眼)；年齡3～13(7.06±2.19)歲。2組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準執行。

1.2觀察指標 ①比較2組眼外肌IGF-1、AnxA1表達；②觀察2組眼外肌組織病理改變，記錄肌纖維排列異常率、Z線異常率、單位面積內線粒體數目、肌纖維截斷面積；③分析共同性外斜視患兒眼外肌IGF-1、AnxA1表達與病理特征及斜視度的關系。

1.3標本取材與保存 共同性外斜視患兒入院均行常規眼科檢查，常規行內直肌縮短術治療，術中截取非注視眼內直肌附著點后5 mm×5 mm眼外肌，液氮凍存備用。同樣方法取對照組內直肌凍存備用。

1.4免疫組織化學染色法測定IGF-1、AnxA1水平 IGF-1、AnxA1檢測采用免疫組織化學染色法，試劑盒均購自美國Sigma公司。眼外肌蠟塊連續切片(3 μm)，脫蠟至水，60 ℃溫箱烘烤24 h，二甲苯脫蠟3次，每次5 min，100%、95%、75%乙醇脫水各2 min，自來水沖洗，蒸餾水浸泡2次，每次5 min，枸櫞酸緩沖液浸泡熱修復15 min，室溫自然冷卻，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3 min。3%過氧化氫去離子水孵育10 min，清除內源性過氧化物酶活性，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次3 min。正常山羊血清封閉15 min，甩去多余液體，加兔抗IGF-1多克隆抗體(1︰50)/兔抗人AnxA1多克隆抗體(1︰300)，4 ℃濕盒內過夜。磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次3 min，滴入生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白G，37 ℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次3 min。加入辣根酶標記鏈霉卵白素，37 ℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次3 min，加入顯色劑顯色5～10 min，蒸餾水浸泡洗滌10 min終止染色，蘇木素復染，蒸餾水沖洗5 min，85%、95%、100%乙醇脫水各5 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用日本Olympus公司BH-2型光鏡下拍照并觀察，隨機取5個高倍視野，觀察肌細胞IGF-1、AnxA1陽性著色情況，以光鏡下胞漿見棕黃色、棕褐色顆粒視為陽性，Image Pro Plus 6.0圖像分析系統自動計算肌細胞IGF-1、AnxA1光密度值。

1.5肌組織病理改變觀察 用顯微手術剪將2組眼內直肌組織剪成2 mm×1 mm×1 mm大小，3%戊二醛固定，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次15 min，四氧化鋨固定2 h后重復洗滌3次，50%、70%、90%乙醇各脫水15 min，90%乙醇及90%丙酮1︰1混合脫水15 min，90%丙酮脫水15 min，100%丙酮脫水3次，每次15 min，環氧樹脂混合液浸泡24 h，定向包埋，37 ℃過夜。45 ℃烘箱內烘烤12 h，60 ℃繼續烘烤24 h，半薄切片定位，超薄切片機切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色。采用日本Olympus公司BX-40型透射電鏡下觀察并拍照，隨機取3個高倍視野觀察肌纖維、肌原纖維超微結構，采用德國OPTON Cooperation公司Image Analyzer圖像分析軟件測定肌纖維直徑、肌纖維截斷面積，計算肌纖維排列不規則比率、Z線異常率、單位面積內線粒體數目[8]。Z線模糊、扭曲或消失任一異常視為Z線異常，異常率=每視野異常Z線/每視野所測總Z線×100%。

2 結果

2.1IGF-1、AnxA1光密度值比較 斜視組IGF-1、AnxA1光密度值均低于對照組(P<0.01)，見表1與圖1～2。

圖1 是否患共同性外斜視2組患兒眼外肌IGF-1表達(SP×200)

表1 是否患共同性外斜視2組患兒眼外肌IGF-1、AnxA1光密度值比較

2.2眼外肌組織病理改變 光鏡下可見斜視組患眼眼外肌肌纖維數量減少，肌絲破壞明顯，伴局灶性肌絲溶解，肌纖維玻璃樣改變，肌纖維結締組織增生，伴不均勻纖維條索樣變，間質成分增多，神經纖維數量減少，漿細胞變性、壞死，肌細胞核內移，伴大量線粒體聚集，肌絲排列紊亂，形態不規則，線粒體異常，呈空泡狀，肌小節Z帶不清晰或消失；光鏡下可見對照組眼外肌均勻分布的肌纖維，排列規則、緊密、整齊，Z帶清晰，群組化明顯，無膠原組織增生。見圖3。斜視組肌纖維排列異常率、Z線異常率及單位面積內線粒體數目均高于對照組，肌纖維截斷面積小于對照組(P<0.01)。見表2。

表2 是否患共同性外斜視2組患兒眼外肌組織病理改變比較

圖2 是否患共同性外斜視2組患兒眼外肌AnxA1表達(SP×200)

圖3 是否患共同性外斜視2組患兒眼外肌光鏡下病理圖像(HE×400)

2.3共同性外斜視患者眼外肌IGF-1、AnxA1表達與病理特征及斜視度的關系 斜視組眼外肌IGF-1表達與AnxA1、肌纖維截斷面積呈正相關(P<0.01)，與肌纖維排列異常率、Z線異常率、單位面積內線粒體數目、斜視度均呈負相關(P<0.01)；AnxA1表達與肌纖維截斷面積呈正相關(P<0.01)，與肌纖維排列異常率、Z線異常率、單位面積內線粒體數目、斜視度均呈負相關(P<0.01)。見表3。

表3 共同性外斜視患兒眼外肌IGF-1、AnxA1表達與病理特征及斜視度的關系

3 討論

既往認為，共同性外斜視患者在注視各方向時偏斜角度相同，眼外肌無明顯器質性病變[9]。但隨著研究不斷深入，越來越多的報道指出，斜視、弱視側眼外肌有明顯病理變化，可出現間質成分增多、肌細胞減少、線粒體病變及肌絲破壞等肌源性損害和細胞結構變性等[10-11]。馬曉梅等[12]研究發現，共同性外斜視患者外直肌光鏡下有明顯纖維萎縮性病變，眼外肌細胞結構直接影響斜視度及手術治療效果。本研究發現，斜視組眼外肌普遍存在纖維變性，Z帶分界欠清晰，肌纖維排列紊亂，線粒體數目增多，肌纖維排列異常率、Z線異常率、單位面積內線粒體數目上升，支持上述結論及國外報道[13]結果，與對照組肌纖維鏡下特征有明顯區別。提示共同性外斜視患者患側眼外肌存在不同程度變性、退化，推測眼外肌肌纖維病理改變可能是產生外斜視的重要原因。共同性外斜視患者肌纖維發育不良、萎縮變性，肌纖維排列紊亂，線粒體供能不足，無法支撐眼內肌完成有效收縮，導致患側眼外肌收縮能力減弱，對側眼外肌肌力相對較強，雙側眼外肌肌力不平衡，故出現眼位偏斜。

共同性外斜視眼外肌肌纖維改變的確切機制尚未完全闡明。新近文獻報道，肌衛星細胞功能與肌纖維改變存在緊密關聯，而成肌調節因子及各類生長因子均影響肌衛星細胞增殖及分化，導致肌纖維結構及功能改變[14]。IGF-1為多功能細胞增殖調節因子，作為刺激因子可與其他細胞周期刺激因子協同促進細胞有絲分離；IGF-1亦屬于合成類激素，可參與蛋白質、糖類、核酸等合成及代謝過程。多項研究證實，IGF-1參與了多種炎癥性疾病、惡性腫瘤的發病過程[15-16]。王麗娜[17]開展的一項動物研究發現，IGF-1可刺激骨骼肌衛星細胞增殖，加速肌纖維收縮。湯志錚等[18]發現，IGF-1與受體結合可誘導晶狀體上皮細胞增殖，參與白內障發病過程。王益丹[19]發現，實驗貓內直肌注射IGF-1后肌衛星細胞數目較空白組增多，認為外源性補充IGF-1可改善肌纖維功能。本研究發現，斜視組IGF-1光密度值較對照組低，且與肌纖維排列異常率、Z線異常率、單位面積內線粒體數目、斜視度呈負相關，與肌纖維截斷面積呈正相關。推測共同性外斜視患者眼外肌IGF-1表達下降會影響肌衛星細胞增殖、分化，降低患眼肌纖維修復能力，造成眼外肌肌纖維紊亂，肌纖維直徑縮短，體積縮小，肌纖維萎縮，進一步影響眼外肌肌力，增加斜視發生風險。且隨IGF-1降低，眼外肌損傷后修復能力弱化，肌力失衡，控制能力降低，斜視度增加，導致斜視進展。故認為IGF-1可能參與共同性外斜視發生與進展過程。

AnxA1屬磷脂結合蛋白家族成員，介導抗炎及細胞黏附、遷移、增殖、分化等生物學過程。既往研究已證實AnxA1可抑制癌細胞增殖、分化[20]。近期有報道指出，AnxA1參與肌細胞膜修復過程，其局部水平升高可促進細胞膜融合[21]。付令利[22]體外實驗發現，肌衛星細胞靜止期與活化后均可表達AnxA1，尤其增殖、分化的肌細胞AnxA1表達水平較高。本研究發現，斜視組眼外肌AnxA1光密度值較對照組低，推測AnxA1參與眼外肌的修復過程。眼外肌AnxA1表達降低，導致肌衛星細胞增殖、分化能力降低，影響肌管形成及修復，造成眼外肌肌力失衡，導致共同性外斜視發生[23]。本研究還發現，共同性外斜視患者眼外肌AnxA1表達與肌纖維排列異常率、Z線異常率、單位面積內線粒體數目、斜視度呈負相關，與肌纖維截斷面積呈正相關，推測AnxA1低表達可能導致肌衛星細胞活化數量減少，造成肌纖維萎縮變性，引起內環境改變，影響眼外肌自身修復，加重肌細胞萎縮變性及肌纖維排列紊亂，造成肌小節破壞及膠原組織增生，而上述病理變化均可能影響眼外肌收縮功能，造成眼外肌過度松弛、收縮力降低，誘發外斜視。

綜上，共同性外斜視患兒眼外肌IGF-1、AnxA1表達較正常眼位兒童降低，二者表達下降可能通過影響肌衛星細胞活化等途徑，引起肌纖維變性、壞死，影響眼外肌自身修復及收縮、控制功能，造成共同性外斜視。