慈苓化濁顆粒對痛風患者腸道微生物的影響

賈二濤，姜毓楷，何思慧，張劍勇

（1.深圳市中醫院，廣東深圳 518033；2.廣州中醫藥大學第四臨床醫學院，廣東深圳 518033；3.南京中醫藥大學附屬深圳市中醫院，廣東深圳 518033）

痛風是由于嘌呤代謝紊亂和（或）尿酸排泄減少，單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）沉積所致的晶體相關性關節病，是臨床常見的風濕病。痛風在我國的總體患病率約為1.1%[1]，近年來隨著我國人民生活水平的提高以及飲食結構和生活習慣的改變，痛風患病率呈明顯上升趨勢，且發病年齡呈年輕化趨勢。高尿酸血癥是導致痛風發作的直接原因，其產生的機制包括尿酸（uric acid，UA）排泄障礙或生成增多，UA升高的另一個途徑是通過攝入和外源性吸收富含嘌呤的食物。肉類攝入會使痛風風險增加21%，海鮮攝入會使痛風風險增加7%[2]。腸道為嘌呤吸收的主要器官，通過腸道排泄的UA比例為30%～40%[3]。因此，定植在人體腸道的微生物對UA的作用引起了人們的關注[4]。前期臨床試驗證明了慈苓化濁顆粒能夠降低痛風患者血中的UA水平[5]。然而，慈苓化濁顆粒降尿酸的相關機制尚不明確。因此，本研究開展了基于腸道菌群探討慈苓化濁顆粒降尿酸的作用機制。現將研究結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2020年11月至2021年4月在深圳市中醫院風濕科門診或病房接受治療并明確診斷為痛風的患者，共30例。本研究獲得深圳市中醫院倫理委員會的審核批準（批件號：K2020-020），并且所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 病例選擇標準

1.2.1 納入標準①符合2015年美國風濕病學會/歐洲抗風濕聯盟的痛風分類標準[6]，并且痛風病程≤3年；②年齡18～70歲，男女不限；③入組前2個月未使用抗生素、微生態活菌制劑等；④能接受并完成相關治療、觀察和檢查，自愿參加本研究并簽署知情同意書的患者。

1.2.2 排除標準符合下述任意條件者，應予以排除：①由腎臟病、血液病，或服用某些藥物、腫瘤放化療、遺傳因素等原因引起的繼發性痛風患者；②有嚴重和不穩定的心腦血管疾病（如不穩定性心絞痛、冠狀血管再生、大腦血管再生、短暫性腦缺血發作、充血性心力衰竭等）、肝功能異常[谷丙轉氨酶（ALT）或谷草轉氨酶（AST）≥2倍正常值上限]、腎功能不全、造血系統疾病的患者；③患有精神性疾病，無自知力，無法確切表達或不能按時服藥的患者；④過敏體質及對本研究用藥過敏的患者；⑤存在嚴重肛周疾病、直腸狹窄等腸道病變的患者；⑥妊娠期、哺乳期及準備妊娠、不愿避孕的患者；⑦前3個月接受過其他臨床試驗的患者。

1.3 治療方案治療期間要求患者低嘌呤飲食，禁止食用動物內臟（尤其是腦、肝、腎）、飲酒、高果糖谷物糖漿的飲料（如汽水、果汁）、益生菌及相關的食物或藥物（如酸奶、金雙歧等）。在此基礎上，給予慈苓化濁顆粒口服治療。用法：慈苓化濁顆粒（為深圳市中醫院中藥協定方制成的復方中藥顆粒劑，由江陰天江藥業股份有限公司生產，產品批號為1306302；方藥組成：土茯苓45 g，川萆薢30 g，秦艽15 g，山慈菇10 g，赤芍10 g，川牛膝10 g，山茱萸6 g），每日1劑，加200 mL開水并攪拌均勻，分2次溫服。連續服用2周。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般資料情況包括患者的性別、年齡、病程等信息。

1.4.2 實驗室生化指標治療前后分別檢測患者的血肌酐（Cr）、尿酸（UA）、空腹血糖（FPG）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。各項實驗室指標的檢測由深圳市中醫院檢驗科統一完成。

1.4.3 糞便標本的采集和檢測

1.4.3.1 標本采集 向受試者提前發放糞便采樣管并介紹取樣方法及注意事項，采用自然排便法，使用采樣管在糞便表面均勻涂抹，最小采樣量為米粒大小糞便（約1 g）。如糞便為水樣便，則在殘渣較多處取固體樣本，盡量避免尿液、馬桶壁等對糞便樣本的污染。糞便標本凍存于-80℃低溫冰箱中待測。

1.4.3.2 腸道菌群的檢測 使用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB）提取樣本微生物的基因組DNA，提取的所有DNA均通過瓊脂糖凝膠電泳法進行分離，并使用Qubit進行基因文庫定量，使用MPS（massively parallel sequencing）Illumina技術對基因組進行測序，通過插入大小為350 bp的配對末端文庫來構建基因文庫，后使用Illumina NovaSeq6000測序系統和PE150策略對350 bp文庫進行測序。

1.4.3.3 腸道菌群的分析 （1）Alpha多樣性分析：指特定群落或樣品組內的物種多樣性，本研究采用Observed Species（Obs）以及Shannon指數來估算群落中的物種多樣性，指數越大，說明生物多樣性越高。（2）Beta多樣性分析：指群落之間的物種多樣性，用以衡量群落之間的差別，本研究采用PcoA分析（principal co-ordinates analysis）進一步展示樣品組間的物種多樣性差異，相似度越高，距離越短，則2組之間的菌群越相似。（3）組間群落差異分析：本研究采用線性判別分析法（LDA effects size，LEfSe）分析組間菌群差異，從而找出組間在豐度上有顯著差異的菌種。

1.5 統計方法采用IBM SPSS Statistic 26.0軟件進行數據的統計分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示。自身治療前后比較，若服從正態分布，采用配對t檢驗；若不服從正態分布，采用Wilcoxon配對秩和檢驗。腸道菌群治療前后群落差異分析采用線性判別分析，該分析首先使用非參數Kruskal-Wallis秩和檢驗檢測不同分組間豐度差異顯著的物種，然后使用Wilcoxon秩和檢驗驗證上一步的差異物種在不同組間的子分組中的差異一致性，最后采用線性回歸分析來估算每個組分（物種）豐度對差異效果影響的大小，LDA score默認預設值為2.0。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料本研究排除2例失訪患者后，最終納入28例痛風患者。其中，男性27例，女1例；年齡最小20歲，最大68歲，平均年齡（30.71±9.44）歲。

2.2 治療前后各項實驗室生化指標比較表1結果顯示：治療后，患者的UA和TG水平均顯著低于治療前（P＜0.01），而治療前后的Cr、FPG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表1 28例痛風患者治療前后各項實驗室生化指標比較Table 1 Comparison of laboratory biochemical indexes of 28 patients with gout before and after treatment （±s，分）

表1 28例痛風患者治療前后各項實驗室生化指標比較Table 1 Comparison of laboratory biochemical indexes of 28 patients with gout before and after treatment （±s，分）

①P＜0.01，與治療前比較

觀察指標UA/（μmol·L-1）Cr/（μmol·L-1）FPG/（mmol·L-1）TG/（mmol·L-1）TC/（mmol·L-1）HDL-C/（mmol·L-1）LDL-C/（mmol·L-1）P值0.000 0.277 0.645 0.001 0.942 0.457 0.420治療前569.91±79.73 90.27±11.75 5.41±0.67 2.61±1.15 4.58±0.83 1.05±0.18 3.30±1.05治療后482.68±70.72①87.95±9.121 5.33±0.40 1.91±0.74①4.59±0.76 1.07±0.15 3.16±0.72 t值5.869 1.117 0.467 3.898-0.073-0.759 0.823

2.3 腸道微生物比較

2.3.1 治療前后腸道微生物Alpha多樣性比較經慈苓化濁顆粒治療后，患者的Obs和Shannon指數與治療前比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），表明治療后腸道菌群的生物多樣性與治療前無顯著性差異，結果見圖1。

圖1 慈苓化濁顆粒治療痛風患者治療前（A）與治療后（B）的Alpha多樣性分析Figure 1 Alpha biodiversity analysis for gout patients before treatment（A）and after treatment（B）

2.3.2 治療前后腸道微生物Beta多樣性比較經PcoA分析，痛風患者治療后的菌群結構與治療前比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖2。

圖2 慈苓化濁顆粒治療痛風患者治療前（A）與治療后（B）的PcoA分析Figure 2 PcoA analysis for gout patients before treatment（A）and after treatment（B）

2.3.3 治療前后腸道微生物LEfSe差異分析經LEfSe分析，治療前痛風患者的放線菌綱、雙歧桿菌科、雙歧桿菌屬、韋榮球菌科、魏斯氏菌屬等菌屬以及治療后的瘤胃球菌屬在2組物種豐度差異中起到重要的作用（圖3）。進一步統計2組有顯著差異菌群的LDA分值，瘤胃球菌屬富集于治療后的樣本中，放線菌綱、雙歧桿菌屬、韋榮球菌科、魏斯氏菌屬等菌屬富集于治療前的樣本中（圖4）。

圖3 慈苓化濁顆粒治療痛風患者治療前（A）與治療后（B）的LEfSe分析Figure 3 LEfSe analysis for gout patients before treatment（A）and after treatment（B）

圖4 慈苓化濁顆粒治療痛風患者治療前（A）與治療后（B）的LEfSe分析Figure 4 LEfSe analysis for gout patients before treatment（A）and after treatment（B）

3 討論

高尿酸血癥或痛風患者存在腸道菌群失調現象，這個結論是肯定的。最近的一項研究表明，高尿酸血癥的發病機制與腸道微生物相關[7]，但腸道菌群的具體發病機制尚不清楚。一些研究報告了痛風患者腸道微生物組的改變[8]，如表達尿囊素酶基因的腸道細菌顯著減少[9]，表明改變的腸道微生物群可能與痛風有關，可能有助于區分痛風患者與健康人群，并作為疾病治療的新目標[10]。研究[11]發現，發酵乳桿菌JL-3通過降解尿酸以降低小鼠血清尿酸水平，與對照組比較，血尿酸降低31.3%。既往研究[12]發現，某些含有尿酸溶解能力的益生菌可用于幫助預防動物中氧嗪酸誘導的高尿酸血癥。同樣，Wang H等[13]已發現有潛在的益生菌可通過減少腸道肌苷來改善果糖引起的高尿酸血癥。

朱丹溪在《格致余論》中認為，本病乃“瘀濁凝澀”所致，由于過食膏粱厚味，濁邪凝滯，阻滯經絡，日久化熱；或因脾失健運，升清降濁無權，水谷不化，生成濁毒，滯留血中，而致濕、痰、熱、瘀等病理產物阻礙氣機，流注關節，氣血凝滯，運行不暢，閉阻不通，“不通則痛”而引發本病。因此，朱良春提出痛風為“濁瘀痹”。慈苓化濁顆粒由土茯苓、川萆薢、秦艽、山慈菇、赤芍、川牛膝、山茱萸等中藥組成，具有祛濁化瘀功效。本研究發現，經慈苓化濁顆粒治療后與治療前相比，痛風患者在菌群結構上無顯著性差異，但是瘤胃球菌屬富集于治療后的樣本中，放線菌綱、雙歧桿菌屬、韋榮球菌科、魏斯氏菌屬等菌屬富集于治療前的樣本中。因此，慈苓化濁顆粒可能通過改變腸道微生物物種豐度以降低血尿酸，但具體的作用機制仍有待進一步深入研究。

綜上所述，慈苓化濁顆粒可有效治療痛風，而通過改變腸道微生物物種豐度以降低血尿酸可能是其作用機制之一。