非酒精性脂肪性肝病鐵死亡機制的基礎研究*

姜 嫄，黃錦明#，梁瑜禎 ，夏 寧

（1.廣西醫科大學第二附屬醫院，南寧 530007；2.廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧 530021）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種與機體代謝異常相關的代謝綜合征，包括單純性脂肪肝（NASFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、脂肪性肝纖維化、脂肪性肝硬化及肝細胞癌，其病理過程為從良性的單純性脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH），最終導致肝硬化和肝細胞癌[1-2]。NAFLD發病機制尚不明確，現主要有“二次打擊”假說和“多重平行打擊”假說[3-4]，目前認為胰島素抵抗（IR）、線粒體功能障礙、內質網應激等因素以及遺傳和表觀遺傳因素等均參與NAFLD的進展[5]，其中肝纖維化的嚴重程度已被確定為NAFLD發病率和死亡率最重要預測因子，各種炎癥刺激組織釋放炎癥因子，損傷肝臟，引起肝臟的纖維化[6]最終導致NAFLD。

鐵死亡（Ferroptosis）是以鐵依賴性脂質活性氧（LipROS）堆積引起脂質過氧化造成的細胞死亡為特征[7]。Tsurusaki 等[8]研究證實了鐵死亡可能觸發了單純脂肪肝變性的炎癥反應，促進NASH的發生發展[9]。因此，研究鐵死亡對NAFLD 的影響，可為治療NAFLD提供新的方向。

本研究采用GEO 數據庫的GSE89632 數據集和鐵死亡數據庫（FerrDb），運用生物信息學方法分析NAFLD 肝組織中表達差異的鐵死亡基因（Fe-DEGS）、疾病相關的信號通路、細胞功能及蛋白互作網絡（PPI）。同時，建立體外NAFLD 細胞模型，進一步驗證Fe-DEGS 基因的表達差異，為NAFLD疾病相關鐵死亡機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 生物信息學分析NAFLD潛在的鐵死亡基因

1.1.1 數據來源 通過GEOquery包從GEO數據庫中下載GSE89632 數據集，該數據集包含63 個樣本[10]，取19例非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者和24 例健康對照（HC）者的肝臟基因表達（Illumina微陣列）進行分析，還從鐵死亡基因數據庫（FerrDb;zhounan.org）獲得了一個包含259個基因的數據集。

1.1.2 數據處理及表達差異分析

通過箱式圖查看樣本標準化的情況，通過PCA圖（ggplot2[3.3.3 版本]）查看樣本分組間聚類情況，利用limma 包進行兩組的差異分析，得到P值后進行多重假設檢驗和校正。通過控制錯誤發現率（FDR）來確定P值的閾值，并調整校正后的P值（q值）[11]。根據篩選標準|log2（FC）|＞1 &p.adj＜0.05，篩選表達差異基因（DEGS），并與鐵死亡數據庫取交集得鐵死亡表達差異基因（Fe-DEGS），繪制鐵死亡基因表達差異的韋恩圖，為了更好地顯示表達差異，分別用R軟件的ggplot2[3.3.3版本]和Complex-Heatmap包[2.2.0版本]繪制火山圖及熱圖。

1.1.3 GO-KEGG分析相關生物學功能及通路富集

GO-KEGG 富集分析是一種計算方法，用來確定一個預定義的基因集在兩種生物狀態（如兩種表型）之間的生物學組成過程（BP），細胞成分（CC），分子功能（MF）及影響通路（KEGG）是否具有統計上顯著的、一致的差異，利用R軟件clusterProfiler包[3.14.3 版本]（用于富集分析）;org.Hs.eg.db 包[3.10.0 版本]（用于ID 轉換）；GOplot 包[1.0.2 版本]（用于計算zscore）進行富集分析，p.adj＜0.05 &qvalue＜0.25 條件下對富集結果進行篩選，篩選結果利用ggplot2包[3.3.3版本]進行可視化分析[12]。

1.1.4 差異表達基因PPI網絡的構建

通過在線工具STING（https：//strin g-db.org/），調節過濾條件參數：中可信度（0.40），下載網絡關系信息，使用Cytoscape 軟件（v3.8.0）對PPI 網絡進行了可視化分析，利用cytohubb 插件進行關鍵基因的篩選[13]。

1.2 NAFLD細胞模型的建立與功能驗證

1.2.1 材料

人肝癌細胞（Hep G2 細胞購自Procell），DMED培養基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、0.25%EDTA胰蛋白酶（購自Bi 公司），棕櫚酸鈉油酸鈉試劑盒（購自西安鯤創生物有限公司），油紅O 染色液試劑盒、牛血清白蛋白、甘油三脂檢測試劑盒（購自Sigma公司），c-jun、Tristetraprolin（ZFP36）、ATF3、IL-6 單克隆兔一抗、β-Actin 多克隆兔一抗、Goat Anti-Mouse IgG2b 二抗（購自CST）；CO2細胞恒溫培養箱（美國Thermo Forma 公司）、酶標儀（美國Thermo 公司）、熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）。

1.2.2 細胞培養方法

HepG2細胞用含10%胎牛血清+10萬U/L青鏈霉素的DMEM培養基培養，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度孵育箱內培養，待細胞融匯至80%時，用0.25%ETDA 胰酶消化，將細胞傳代用于后續實驗。

1.2.3 NAFLD體外模型的建立

根據文獻造模采用濃度1 mmol/L油酸鈉（OA）和棕櫚酸鈉（PA）混合物即FFA（OA∶PA=1∶2）干預24 h[14-15]。接種HepG2于24孔板中，用無血清DMEM培養基培養，分為正常組、對照組、FFA 組并設置3 個復孔，細胞傳代穩定至細胞融合度為60%～70%時撤去原有培養基，按正常組（只含無血清培養基）、對照組（含FFA 對照液的培養基）、FFA 組（含1 mmol/L FFA的培養基）干預24 h。

1.2.4 油紅O染色觀察細胞內脂滴

各組細胞干預24 h 后，倒掉培養基，PBS 洗滌細胞2 次；用含10%甲醛的磷酸鹽緩沖液固定細胞10 min；PBS 漂洗3 次（3 min）；60%異丙醇浸洗5 min；室溫下用已過濾的油紅0 工作液染細胞20 min；棄去染色液，PBS 漂洗3～5遍至無殘留染色液；蘇木素復染2 min后棄去,PBS 漂洗3次；加入緩沖液1 min 后棄去；加入蒸餾水覆蓋后用顯微鏡觀察；顯微鏡下可見細胞內的中性脂肪可被特異性地染成棕紅色。

1.2.5 細胞內甘油三脂含量測定

各組細胞干預24 h 后，收集細胞至離心管內，離心棄上清，加正庚烷和異丙醇（體積比1∶1）混合液1 mL，超聲波破碎1 min（強度20%，超聲2 s，停1 s），8 000 g，4℃離心10 min，取上清待測。將酶標儀預熱30 min，調節波長到420 nm，蒸餾水調零；水浴鍋預熱到65 ℃；按甘油三酯含量檢測試劑盒說明書配置相應的空白管、標準管和測定管；充分混勻，65 ℃水浴15 min，冷卻后吸取200 μL 至96 孔板測定420 nm 處吸光度，記為A 空，A 標和A 測。（空白管和標準管需檢測1～2 次。）根據試劑盒說明書提供的公式計算細胞內甘油三酯含量：細胞甘油三酯含量（mg/104cell）=C標準品×（A測-A空）÷（A 標-A空）÷細胞密度（C 標準品：1 mg/mL；細胞密度：104cell/mL）。

1.2.6 Western blotting 檢測c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6蛋白的表達情況

各組細胞干預24 h后，按照RIPA蛋白裂解緩沖液使用說明書提取各組總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，等濃度稀釋并加上樣緩沖液后煮沸變性，配制12%SDS-PAGE 膠每孔上樣10 μL，70 V 電泳至marker 分離加壓至110 V 電泳至底部后，將目的蛋白切下，半干轉將蛋白全部轉移到0.22 μm PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入稀釋后的IL-6、ATF3、c-jun、Tristetraprolin（ZFP36）的單克隆兔一抗（1∶1 000）和β-Actin 多克隆兔一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，再用稀釋后的Goat Anti-Mouse IgG2b（1∶10 000）二抗室溫孵育1 h；TBST 洗膜3次，每次10 min，采用熒光顯色，用Image J 軟件進行灰度值分析。目的蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度值/內參β-Actin灰度值。每組設3個平行孔，實驗重復3次。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0 統計軟件進行數據處理，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學分析非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）潛在的鐵死亡基因

2.1.1 NASH鐵死亡相關差異基因篩選結果及PPI網絡的構建

取19 例非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者和24 例健康對照（HC）者的肝臟基因表達（Illumina微陣列）進行分析，來自GSE89632數據集的樣本箱式圖（圖1A）樣本標準化數據近似為直線和正態分布，PCA圖（圖1B）樣本分組間聚類在同一平面上；根據篩選條件log2FC＞1或log2FC＜-1，P＜0.05，篩選出487 個差異基因，篩選出的差異基因與來自鐵死亡基因數據庫的259 個基因取交集得9 個NASH鐵死亡基因（Fe-DEGS），繪制韋恩圖（圖1C），其中8個上調基因:JUN、ZFP36、SOCS1、ATF3、MIOX、PTGS2、IL-6、SLC2A3，1 個下調基因：FADS2，繪制其熱圖及火山圖（圖2A、B）。可視化分析顯示，JUN、ZFP36、SOCS1、ATF3、PTGS2、IL-6間有網絡關系（圖2C）。

圖2 基因篩查相關圖

2.1.2 NASH 鐵死亡相關差異基因功能及通路富集

利用R 軟件clusterProfiler 和GOplot 包 對NASH鐵死亡相關差異基因進行GO-KEGG富集分析，在p.adj＜0.05 &qvalue＜0.25 條件下對富集結果進行篩選，BP 共有275 條，CC 共有6 條，MF 共有21 條，KEGG 共有21 條；其關鍵功能及通路富集如下表（表1），并對其進行可視化分析（圖3）。

圖3 GO功能富集分析圖

表1 GO-KEGG關鍵功能和通路的富集分析

2.2 NAFLD細胞模型的建立與功能驗證

2.2.1 油紅O染色觀察細胞內脂滴

在FFA組內可見大量的棕紅色顆粒，在對照組及正常組內棕紅色顆粒明顯減少。FFA 干預HepG2 細胞引起大量脂肪沉積（圖4），因此FFA 干預后成功建立NAFLD細胞模型。

圖4 細胞油紅染色結果圖

2.2.2 細胞內甘油三脂含量測定

與正常組、對照組比較、FFA組細胞內甘油三脂含量升高（P＜0.05）（圖5），因此進一步表明FFA 干預后成功建立NAFLD細胞模型。

圖5 細胞甘油三酯含量測定圖

2.2.3 Western blotting 檢測c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6蛋白的表達情況

與正常組、對照組比較，FFA 組c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6 蛋白表達升高（P＜0.05）,見圖6、表2。說明在NAFLD 細胞模型中c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6過表達。

圖6 各組c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6蛋白的表達情況

表2 3組ATF-3、ZEP36、c-jun、IL-6蛋白表達量比較

表2 3組ATF-3、ZEP36、c-jun、IL-6蛋白表達量比較

與正常組和對照組比較，*P＜0.05。

3 討論

NAFLD 發病率逐漸增高，已成為威脅人類健康的重大疾病，疾病的發展從單純性脂肪變性到NASH，最終導致肝硬化和肝細胞癌。NAFLD的發病機制復雜，有研究表明，在NAFLD發病過程中發生鐵死亡，但其中的機制并不明確，所以本文利用生物信息學解釋NAFLD 發生鐵死亡的相關機制。本研究根據GSE89632數據集和鐵死亡基因數據庫交集得出9 個（FADS2、JUN、ZFP36、SOCS1、ATF3、MIOX、PTGS2、IL-6、SLC2A3）Fe-DEGS基因。

本研究中通過GO-KEGG 富集分析Fe-DEGS基因主要在脂肪分化、氧化應激、三價鐵（Fe3+）結合方面富集。其中脂肪細胞的異常分化導致NAFLD疾病的進展，主要表現在脂肪細胞的異位沉積和脂質因子的過表達等[16]，在“二次打擊”學說中，NAFLD 肝細胞脂肪變性后加上氧化應激及脂質過氧化，使肝細胞及其線粒體發生持續性損傷[17-18]，在內質網應激反應和脂肪變性的過程中一些酶和轉運蛋白的作用使Fe3+進入到細胞質和線粒體基質，變成具有氧化還原活性的二價鐵（Fe2+），形成一個不穩定鐵池，這些具有氧化還原活性的鐵會通過芬頓反應催化產生ROS，鐵依賴產生的LipROS 與脂質發生過氧化反應，從而誘導細胞鐵死亡[19-20]。本研究中GO-KEGG 富集分析在IL-17 通路，而在NAFLD 小鼠模型研究中發現，IL-17 通路的激活可促進小鼠脂肪肝的形成，敲除通路中關鍵基因IL-17RA 基因可以抑制IL-17 通路，最后抑制NAFLD的發展[21]。因此，氧化應激等因素可能通過IL-17通路引起脂質的沉積和過氧化從而引起鐵死亡。

本研究中篩選出的9 個（FADS2、JUN、ZFP36、SOCS1、ATF3、MIOX、PTGS2、IL-6、SLC2A3）Fe-DEGS 基因，根據PPI 網絡可見JUN、ZFP36、SOCS1、ATF3、PTGS2、IL-6具有緊密關系，JUN 基因最早被發現是在禽類肉瘤病毒17（ASV17）復制缺陷的轉化細胞中[22]，JUN 基因包括c-jun、junB 和junD 3 種基因，c-jun是核內轉錄因子（AP-1）家族成員之一，c-jun 可以防止肝臟內質網過度激活，從而減輕肝臟的損傷[23]；ZFP36也被稱為鋅指蛋白36，是鋅指蛋白家族的成員，研究表明，ZFP36是慢性乙型肝炎感染過程中炎癥反應的關鍵調節因子，抑制ZFP36 的表達，可以上調IL-6 等炎性細胞因子表達[24]，長期升高的IL-6 可促進小鼠肝臟和脂肪組織對胰島素的抵抗[25]；ZFP36 過表達抑制脂肪細胞產生IL-6 蛋白，改善肝臟和脂肪組織胰島素抵抗[26]。與此同時SOCS1蛋白促炎癥細胞因子如TNFα、IL-6 的產生增加，導致肝臟缺血再灌注損傷和肝細胞缺氧/復氧損傷加重[27]。本研究結果顯示，在FFA刺激HepG2細胞建立的NAFLD模型中細胞發生脂質沉積，western blotting結果提示c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6 表達升高，JUN、ZFP36、IL-6、SOCS1具有相互作用關系，在調控NAFLD 炎癥發生過程中起關鍵作用。因此，干預c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6 表達有望成為預防和治療NAFLD 發生和發展的一大前景。

本研究中通過生物信息學方法及體外實驗闡述了NAFLD 與鐵死亡之間的關系，c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6在NAFLD發展過程中可能起關鍵功能，在NAFLD 中鐵死亡基因c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6表達升高，但是鐵死亡與NAFLD 之間的機制過程需要進一步實驗驗證。因此，研究鐵死亡機制在NAFLD 發病過程中的作用，有望為預防和治療NAFLD提供新的方向28。