七葉亭對高糖誘導的視網膜色素上皮細胞HIF-1α/BNIP3通路介導自噬的影響*

陳 平，魏雪梅，談麗麗

（青海省第五人民醫院眼科，西寧 810000）

糖尿病性視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的常見并發癥，也是患者視力障礙和失明的主要原因[1]。視網膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）細胞是視網膜屏障的重要組成部分，也是維持視覺系統正常功能的關鍵因素[2]。持續的高血糖刺激會誘導RPE 細胞的氧化應激和細胞凋亡，從而促進血視網膜屏障損傷和DR進展[3]。自噬激活能夠清除氧化應激誘導的RPE 細胞受損的細胞器和毒性物質，減輕細胞損傷[4]；缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）可通過調控E1B-19 ku 相互作用蛋白3（adenovirus E1B 19 kuinteracting protein 3，BNIP3）促進自噬，并在缺氧的人神經母細胞瘤細胞中發揮神經保護作用[5]。七葉亭在糖尿病、肥胖、心血管疾病等中具有預防和抵抗氧化應激、炎癥反應等作用[6-7]。而且，七葉亭對糖尿病性神經病的治療效果顯著[8]。目前，對于七葉亭在DR 中的作用機制還少有研究，故本研究通過高糖誘導RPE細胞，分析不同濃度七葉亭處理對HIF-1α/BNIP3通路介導的自噬的影響，為七葉亭治療DR提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

人RPE細胞系ARPE-19，美國ATCC細胞庫；七葉亭（98%，246573），美國Sigma 公司；DMEM/F12培養基（A4192001）、胎牛血清（16140063）、青霉素-鏈霉素（15070063）、胰蛋白酶（15050057），美國Gibco 公司；2-甲氧雌二醇（2-Methoxyestradiol，2ME2）（S1233），美國selleck 公司；兔抗人β 連環蛋白（β-catenin）（ab32572）、自噬微管相關蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）（ab48394）、Beclin-1（ab207612）、HIF-1α（ab51608）、BNIP3（ab109362）、GAPDH（ab234437）、辣根過氧化物酶標記二抗（ab205718），英國Abcam 公司；蛋白提取試劑盒（P0033）、BCA 蛋白定量試劑盒（P0012）、細胞計數盒8（CCK-8）試劑盒（C0037）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（S0033），上海碧云天生物公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）（ml077385）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）（ml058097）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒，上海酶聯生物公司。

熒光顯微鏡，日本Olympus 公司；Multiskan FC酶標儀，美國賽默飛世爾公司；EM UC7 超薄切片機，德國Leica 公司；H-7500 透射電子顯微鏡，日本日立公司；UVP凝膠成像系統，美國UVP公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

ARPE-19細胞加至含有10%胎牛血清、1%青霉素—鏈霉素的DMEM/F12 培養基中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，細胞融合度達到80%左右時進行傳代，細胞生長至對數期時進行后續實驗。

1.2.2 細胞處理

收集“1.2.1 項”中培養至3～5 代的APRE-19 細胞，并分為對照組：含5.5 mmol/L 葡萄糖培養液培養）；高糖組：含25 mmol/L 葡萄糖培養液[9]；七葉亭（1.0 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L）處理組：加入含25 mmol/L 葡萄糖和（1.0 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L）七葉亭溶液[10]；七葉亭+2ME2 組：加入含25 mmol/L 葡萄糖、5.0 μmol/L 七葉亭和1.0 μmol/L的2ME2 培養液[11]，各組均置于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養。

1.2.3 細胞活性測定

收集“1.2.2 項”中各組APRE-19 細胞，以5×103個/孔的濃度加至96 孔板，加入10 μL CCK-8 試劑，37 ℃避光培養4 h，棄上清，酶標儀490 nm波長處檢測每孔吸光度OD 值，計算細胞活力（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

提取“1.2.1項”中各組細胞總蛋白，BCA檢測試劑盒測定濃度，對蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉，加入一抗β-catenin、GAPDH，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液（1∶2 000），室溫孵育1 h。蛋白凝膠成像系統成像，Image Pro Plus 6.0圖像軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.4 ROS水平測定

收集“1.2.2項”中各組APRE-19細胞，調整細胞濃度為1×106個/mL，加至10 μmol/L 的DCFH-DA（無血清培養液稀釋）中，37 ℃，孵育20 min，流式細胞儀488 nm激發波長和525 nm發射波長檢測ROS熒光強度。

1.2.5 炎癥因子水平測定

收集各組APRE-19 細胞，4 ℃，3 000 r/min 離心，收集上清。利用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-6的水平。

1.2.6 細胞自噬水平檢測

收集“1.2.2 項”中各組APRE-19 細胞，2 000 r/min 離心5 min，棄上清。4 ℃，2.5%戊二醛固定24 h，1%四氧化鋨固定2 h。乙醇脫水后，將其制成50 nm 的樹脂切片，3%醋酸鈾—櫞酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡觀察細胞超微結構并拍照。按照“1.2.3 項”中的方法測定各組APRE-19 細胞中蛋白Beclin1、LC3的相對表達水平。

1.2.7 HIF-1α/BNIP3通路蛋白表達測定

根據“1.2.3 項”中的蛋白測定方法檢測各組APRE-19 細胞中蛋白HIF-1α、BNIP3 的相對表達水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析。計量資料采用平均數±標準差（）描述，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 七葉亭對高糖誘導的APRE-19 細胞活力的影響

與對照組比較，高糖組細胞活力、β-catenin表達顯著降低（P＜0.05）；與高糖組比較，七葉亭（1 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L）處理組細胞活力、β-catenin表達依次升高（P＜0.05）；與5.0 μmol/L七葉亭組比較，七葉亭+2ME2組細胞活力、β-catenin表達顯著降低（P＜0.05）（表1，圖1）。

圖1 七葉亭對高糖誘導的APRE-19細胞增殖蛋白的影響

表1 七葉亭對高糖誘導的APRE-19細胞活力的影響 n=6，

表1 七葉亭對高糖誘導的APRE-19細胞活力的影響 n=6，

與對照組比較，aP＜0.05；與高糖組比較，bP＜0.05；與5.0 μmol/L七葉亭組比較，cP＜0.05。

2.2 七葉亭對高糖誘導的APRE-19細胞ROS含量的影響

與對照組比較，高糖組ROS含量顯著升高（P＜0.05）；與高糖組比較，七葉亭（1 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L）處理組ROS 含量依次降低（P＜0.05）；七葉亭+2ME2 組ROS 含量顯著高于5.0 μmol/L 七葉亭組（P＜0.05）（表2，圖2）。

圖2 熒光顯微鏡觀察ARPE-19細胞ROS熒光圖像（×200）

表2 七葉亭對高糖誘導的APRE-19細胞ROS含量的影響 n=3，

表2 七葉亭對高糖誘導的APRE-19細胞ROS含量的影響 n=3，

與對照組比較，aP＜0.05；與高糖組比較，bP＜0.05；與5.0 μmol/L七葉亭組比較，cP＜0.05。

2.3 七葉亭對高糖誘導的APRE-19 細胞炎癥因子的影響

與對照組比較，高糖組TNF-α、IL-6水平顯著升高（P＜0.05）；與高糖組比較，七葉亭處理組（1 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L）TNF-α、IL-6水平顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與5.0 μmol/L七葉亭組比較，七葉亭+2ME2組TNF-α、IL-6水平顯著升高（P＜0.05）（表3）。

表3 七葉亭對高糖誘導的APRE-19 細胞炎癥因子水平的影響 n=3，

表3 七葉亭對高糖誘導的APRE-19 細胞炎癥因子水平的影響 n=3，

與對照組比較，aP＜0.05；與高糖組比較，bP＜0.05；與5.0 μmol/L七葉亭組比較，cP＜0.05。

2.4 七葉亭對高糖誘導的APRE-19 細胞自噬的影響

與對照組比較，高糖組自噬小體數目增多；與高糖組比較，七葉亭（1 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L）處理組自噬小體/自噬泡數目增多；與5.0 μmol/L七葉亭組比較，七葉亭+2ME2組自噬小體數目減少（圖3）。

圖3 透射電鏡觀察APRE-19細胞的自噬

高糖組Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達顯著高于對照組（P＜0.05）；七葉亭（1 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L）處理組HIF-1α、BNIP3 表達顯著高于高糖組，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；七葉亭+2ME2 組Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達顯著低于5.0 μmol/L 七葉亭組（P＜0.05）（表4，圖4）。

圖4 WB檢測各組自噬蛋白的表達

表4 七葉亭對高糖誘導的APRE-19細胞自噬蛋白的影響 n=3，

表4 七葉亭對高糖誘導的APRE-19細胞自噬蛋白的影響 n=3，

與對照組比較，aP＜0.05；與高糖組比較，bP＜0.05；與5.0 μmol/L七葉亭組比較，cP＜0.05。

2.5 七葉亭對高糖誘導的APRE-19 細胞HIF-1α/BNIP3通路蛋白的影響

與對照組比較，高糖組HIF-1α、BNIP3 表達顯著升高（P＜0.05）；與高糖組比較，七葉亭（1 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L）處理組HIF-1α、BNIP3 表達顯著升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與5.0 μmol/L七葉亭組比較，七葉亭+2ME2 組HIF-1α、BNIP3 表達顯著降低（P＜0.05）（表5，圖5）。

表5 七葉亭對高糖誘導的APRE-19 細胞HIF-1α/BNIP3 通路蛋白的影響 n=3，

表5 七葉亭對高糖誘導的APRE-19 細胞HIF-1α/BNIP3 通路蛋白的影響 n=3，

與對照組比較，aP＜0.05；與高糖組比較，bP＜0.05；與5.0 μmol/L七葉亭組比較，cP＜0.05。

圖5 七葉亭對高糖誘導的APRE-19 細胞HIF-1α/BNIP3 通路蛋白的影響

3 討論

DR 是糖尿病性微血管病變最主要的表現，也是工作年齡段的成年人致盲的主要原因之一[12]。RPE細胞位于脈絡膜和視網膜之間，其側面與毗鄰細胞的包膜之間形成不同寬度的細胞間隙，形成緊密連接，構成血-視網膜屏障[13]。RPE 細胞是DR 進程中最重要的細胞，研究表明，高血糖導致的氧化應激和炎癥反應在DR 進程中起關鍵作用[14-15]。本研究通過高糖誘導AEPR-19 構建RPE 細胞損傷模型，結果顯示，高糖組細胞活力、β-catenin 表達顯著降低，ROS 含量、TNF-α、IL-6 水平顯著升高，這與Qian 等[16]研究結果一致，提示高糖可能通過氧化應激誘導ARPE-19細胞損傷，抑制氧化應激對RPE細胞損傷的作用可能減緩DR進程。

七葉亭又稱為6,7-二羥基香豆素，具有抗炎、抗氧化、血管保護等多種病理作用。Zhang 等[17]報道七葉亭能夠降低人角膜上皮細胞中ROS含量，使其免受氧化損傷。Srilatha 等[8]研究發現，七葉亭可顯著降低糖尿病周圍神經病變大鼠血清糖化血紅蛋白含量和過氧化物酶活性，進而改善大鼠的協調性和行為功能。Xu等[18]指出，七葉亭通過抑制氧化應激引起的自噬減輕短暫性雙側頸動脈閉塞小鼠模型的神經功能缺損。本研究結果表明，七葉亭可抑制高糖誘導的ARPE-19 細胞ROS 含量及炎癥因子水平，促進細胞增殖，提示七葉亭可能抑制高糖誘導的ARPE-19細胞損傷。

自噬在真核細胞內廣泛存在，通過消除細胞內受損細胞器和蛋白質維持細胞內穩態。研究顯示，棕櫚酸和油酸處理可導致肝癌細胞自噬[19]。也有研究表明，高糖環境下自噬激活能夠清除細胞中的毒性物質及受損線粒體等細胞器，維持細胞內環境穩定，延緩DR 進程[4]。本研究發現，高糖誘導促進AEPR-19 細胞的自噬，自噬蛋白beclin1、LC3 表達顯著升高，提示自噬可能與DR發生有關。HIF-1在人和哺乳動物體內廣泛分布，缺氧環境下，ROS 的產生能夠激活HIF-1α，進而調控下游靶基因，維持細胞穩態[20]。BNIP3正常生理條件下處于低表達狀態，當細胞缺氧、缺血時，HIF-1α可結合HIF-1β形成復合體，激活BNIP3。Feng等[21]研究表明，BNIP3過表達能夠誘導自噬，而敲除BNIP3會加重RPE細胞D407的缺氧損傷。Fu等[22]研究表明，HIF-1α/BNIP3通路介導的自噬能夠通過抑制ROS 生成減輕缺血再灌注引起的急性腎損傷。本研究結果表明，高糖誘導下蛋白HIF-1α、BNIP3 表達顯著升高，提示HIF-1α/BNIP3 信號通路介導的自噬參與DR 發展。2ME2 是HIF-1α 的特異性抑制劑，可抑制HIF-1α/BNIP3 通路激活，從而影響自噬。本研究通過在高糖誘導的APRE-19細胞中添加2ME2來分析七葉亭對細胞自噬的調控作用及其與HIF-1α/BNIP3 通路的關系。結果顯示，2ME2 逆轉了七葉亭對高糖誘導的ARPE-19 細胞損傷的保護作用，其細胞活力、β-catenin 表達、ROS 含量、TNF-α、IL-6 水平均得到恢復。而且，2ME2 可使七葉亭對高糖誘導的ARPE-19細胞自噬的促進作用、HIF-1α、BNIP3蛋白的上調表達得到逆轉。猜測七葉亭可能通過促進HIF-1α/BNIP3 信號通路介導的自噬減輕高糖對ARPE-19 細胞的損傷，與以上研究結果不一致，原因可能是不同刺激和細胞環境下，自噬可以促進細胞凋亡，輕度自噬有利于對細胞的保護，而自噬過度則會引起細胞凋亡[4]。因此，有關七葉亭影響HIF-1α/BNIP3 通路介導的自噬在DR 中的可能機制，還需進一步的深入研究。

綜上所述，七葉亭可能通過促進HIF-1α/BNIP3信號通路介導的自噬減輕高糖對ARPE-19 細胞的損傷，可能為DR臨床治療提供參考依據。然而，本研究僅從細胞水平上分析了七葉亭在DR治療中的可能機制，下一步需結合基礎實驗對其機制和作用進行驗證。