胃癌外泌體MiR-221靶向PTEN促進腫瘤相關成纖維細胞的形成*

馬麗麗，蘇 瑩，柳 江

（新疆維吾爾自治區人民醫院腫瘤科，烏魯木齊 830000）

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，在我國胃癌死亡率位居惡性腫瘤死亡率第5 位。目前，胃癌的主要治療方式仍然為手術治療，但是患者術后5 年生存率低于25%。大多數胃癌的發病機制復雜，發展過程受多種因素影響[1-3]。所以，探究更多胃癌的發生發展機制對于胃癌的治療至關重要。腫瘤微環境組分復雜，外泌體為腫瘤細胞分泌的攜帶遺傳物質的納米級囊泡，可調控腫瘤微環境中的血管內皮細胞、免疫細胞、基質細胞、腫瘤干細胞等[4-5]，其中，外泌體miRNA 調控腫瘤相關成纖維細胞的形成已經在多種腫瘤中被報道，如肺癌外泌體miR-1247-3p可調控腫瘤相關成纖維細胞的形成，肝癌外泌體miR-21 促進腫瘤相關成纖維細胞的形成而誘導肝癌的轉移[6-7]。MiR-221 激活A20/c-Rel/CTGF 信號通路而促進乳腺癌腫瘤相關成纖維細胞的形成[8]，并且在胃癌中高表達[9]。本文旨在探討miR-221 在胃癌外泌體中的表達及外泌體miR-221對腫瘤相關成纖維細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人成纖維細胞HKF，人胃黏膜細胞GES-1，人胃癌細胞株MGC-803、MKN45（購自美國ATCC 細胞庫），脂質體LipofectamineTM 2000 試劑盒和Trizol試劑盒（購自美國Invitrogen公司），逆轉錄試劑盒和SYBR Green qPCR 試劑盒（購自TaKaRa 公司），MMP-9、α-SMA、Fibronectin、Vimentin、CD9、TSG101、CD63、PTEN、GAPDH、Anti-rabbit IgG（購自美國Cell Signaling Technology 公司），白介素（IL）-6、IL-1β的Elisa檢測試劑盒（購自天津安諾瑞康生物技術有限公司）。

1.2 細胞培養

GES-1、MGC-803、MKN45、HKF細胞培養于含10%FBS 的DMEM 培養基中，取液氮保存的細胞，迅速融化后轉移至細胞培養皿中，置于細胞培養箱中培養至匯合率達80%時進行細胞傳代，隔天更換培養基。

1.3 外泌體的提取與鑒定

將各組肺癌細胞的培養基更換為含10%無外泌體FBS的DMEM培養基中，培養48 h后收集細胞培養液，3 000 g，4 ℃離心15 min，取上清；6 000 g離心40 min，取上清；10 000 g離心1 h，取上清；100 000 g離心1 h，收集沉淀即為外泌體，外泌體用400 μL無菌PBS 重懸，使用透射電鏡觀察外泌體的結構特征，western blotting 檢測外泌體標志蛋白CD9、CD63、TSG101的表達。

1.4 細胞分組與轉染

將HKF 細胞分為GES-1 exo 組、MGC-803 exo組、MKN45 exo 組、PBS 組（分別與10 μg/mL 的GES-1 exo、MGC-803 exo、MKN45 exo 和等體積的PBS 共孵育48 h），以及MGC-803/miR-NC exo 組和MGC-803/miR-221 exo 組（分別與10 μg/mL 的MGC-803/miR-NC exo和MGC-803/miR-221 exo共孵育48 h）。MGC-803 細胞分為miR-NC 組和miR-221mimic 組（使用LipofectamineTM 2000 試劑盒將miR-NC和miR-221mimic轉染至MGC-803細胞）。

1.5 qRT-PCR檢測mRNA表達

外泌體miRNA 的提取使用The exoRNeasy serum/Plasma Maxi Kit，細胞中RNA 提取使用Trizol試劑盒，根據miRNA cDNA Sythesis Kit 和Eva Green miRNA qPCR MasterMix 進行miRNA 的qRTPCR 反應，根據PrimeScriptTM試劑盒和PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix 試劑盒進行mRNA 的qRT-PCR反應。使用2-ΔΔCT法計算相對表達量，引物序列見表1。

表1 引物的序列

1.6 ELIAS檢測細胞培養上清中IL-1β和IL-6的濃度

將各組細胞培養48 h 后收集細胞培養上清，根據ELIAS試劑盒說明書，在96孔板標準品孔中加入50 μL標準品，待測樣品孔加入40 μL細胞上清液和10 μL 生物素標記抗體，然后各孔分別加入100 μL辣根過氧化物酶標記抗體，37 ℃孵育75 min 后，清洗5 次后，分別加入50 μL 顯色劑Ⅰ/Ⅱ，避光反應15 min，每孔加入50 μL 終止液，使用酶標儀于450 nm波長處測吸光度，根據標準曲線計算IL-1β和IL-6濃度。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗

數據庫預測miR-221 與PTEN 的結合位點，根據脂質體2000轉染試劑盒，將PTEN野生型（pGL3-PTEN WT）和突變型質粒（pGL3-PTEN MUT）轉染至293T 細胞，轉染成功后，分別向上述細胞中轉染miR-NC 和miR-221 mimic，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組熒光強度。

1.8 Western blotting檢測蛋白表達

RIPA試劑盒提取各組細胞總蛋白，BCA蛋白定量后，加入上樣緩沖液，沸水浴5 min，使蛋白質充分變性，每組10 μg 蛋白上樣進行SDS-PAGE 凝膠電泳，蛋白分離后轉膜，PVDF 膜用5%脫脂牛奶封閉2 h后與一抗孵育過夜，洗膜后用1∶2 000比例稀釋二抗室溫孵育1.5 h，洗膜后用ECL 試劑盒顯影，拍照，用Image J軟件對曝光結果進行定量分析。

1.9 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行數據分析，所有數據以均值±標準差（）表示，多組間差異使用方差分析（one-way ANOVA），兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌外泌體的鑒定結果

透射電鏡觀察外泌體結構顯示，GES-1 exo、MGC-803 exo、MKN45 exo具有雙層膜結構，粒徑在150 nm 左右并且表達外泌體標志蛋白CD9、CD63、TSG101，符合外泌體的結構及生物學特征，見圖1。

圖1 外泌體鑒定結果

2.2 MiR-221高表達于胃癌細胞及其外泌體

與GES-1 細胞比較，MiR-221 在MGC-803 和MKN45 中的表達顯著增加（均P＜0.001），與GES-1 exo 比較，MGC-803 exo、MKN45 exo 中miR-221表達顯著增加（均P＜0.001），見圖2。

圖2 qRT-PCR鑒定miR-221表達

2.3 胃癌外泌體促進腫瘤相關成纖維細胞的形成

與GES-1 exo 組細胞比較，MGC-803 exo 組和MKN45 exo 組HKF 細胞中腫瘤相關成纖維細胞MMP-9、α-SMA、Fibronectin、Vimentin 表達顯著上調（P＜0.001），腫瘤相關成纖維細胞特異性細胞因子IL-1β、IL-6 表達顯著上調（P＜0.001），細胞上清中IL-1β和IL-6濃度顯著增加（P＜0.01），見圖3。

圖3 外泌體對腫瘤相關成纖維細胞相關標志物表達和分泌的影響

2.4 外泌體miR-221 促進腫瘤相關成纖維細胞形成

在MGC-803 細胞中轉染miR-221 mimic 以及miR-NC，提取轉染后細胞分泌的外泌體miR-221 exo 和miR-NC exo，與miR-NC exo 組比較，miR-221 exo組中miR-221表達顯著上調（均P＜0.001），將miR-NC exo和miR-221 exo與HKF細胞孵育，與miR-NC exo 組比較，miR-221 exo 組HKF 細胞中MMP-9、α-SMA、Fibronectin、Vimentin 表達顯著上調（P＜0.001），IL-1β、IL-6 表達顯著上調（均P＜0.001），細胞上清中IL-1β 和IL-6 濃度顯著增加（均P＜0.001），見圖4。

圖4 外泌體miR-221對腫瘤相關成纖維細胞相關標志物表達和分泌的影響

2.5 PTEN為miR-221的靶基因

MiRDB數據庫預測PTEN與miR-221結合位點如圖5A 所示，雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果顯示，pGL3-PTEN WT 組293T 細胞轉染miR-221 mimic 后其熒光強度顯著低于轉染miR-NC 組細胞（P＜0.001），pGL3-PTEN MUT 組293T 細胞轉染miR-221 mimic 與miR-NC 后熒光強度無顯著變化。并且與miR-NC組比較，miR-221 mimic組HKF細胞中PTEN表達顯著下調（P＜0.001），與miR-NC exo 組比較，miR-221 exo 組PTEN 表達顯著下調（P＜0.001），見圖5。

圖5 PTEN為miR-221靶基因

2.6 外泌體miR-221抑制PTEN表達而促進腫瘤相關成纖維細胞的形成

qRT-PCR 檢測結果顯示，與miR-NC exo 組比較，miR-221 exo組HKF細胞MMP-9、α-SMA、Fibronectin、Vimentin 表達顯著上調（P＜0.001），IL-1β、IL-6表達顯著上調（P＜0.001），細胞上清中IL-1β和IL-6濃度顯著增加（P＜0.001），而與miR-221 exo組比較，miR-221 exo+PTEN 組細胞中MMP-9、α-SMA、Fibronectin、Vimentin 表達顯著下調（P＜0.001），IL-1β、IL-6 表達顯著下調（P＜0.001），細胞上清中IL-1β和IL-6濃度顯著降低（P＜0.001），見圖6。

圖6 外泌體miR-221調控PTEN對腫瘤相關成纖維細胞相關標志物表達和分泌的影響

3 討論

惡性腫瘤的治療以及預后評價大多聚焦于腫瘤本身，近年來，腫瘤微環境中的各類細胞在腫瘤治療和預后評估等臨床行為中的價值受到了越來越多的關注。腫瘤微環境是指腫瘤的發生、生長及轉移的復雜的網絡環境，腫瘤微環境組成復雜，包括腫瘤細胞、腫瘤干細胞、免疫細胞、基質細胞、成纖維細胞等細胞組分[10-11]，也包括細胞因子、胞外基質、胞外囊泡等，腫瘤微環境中可調控腫瘤的生長、轉移、血管新生、免疫逃逸等病理過程[12-13]。腫瘤外泌體是腫瘤細胞分泌的納米級囊泡，粒徑在30～150 nm之間，內含多種遺傳物質，其中miRNA是外泌體中的重要內含物之一[14]，外泌體miRNA可通過多種途徑調控腫瘤微環境中的血管生成、腫瘤相關成纖維細胞的形成、腫瘤相關巨噬細胞的形成[15]。如乳腺癌外泌體miR-9可誘導腫瘤相關成纖維細胞的形成[16]，黑色素瘤外泌體miR-155-5p激活SOCS1/JAK2/STAT3 通路而促進腫瘤相關成纖維細胞的形成[17]，肺癌外泌體中miR-210調控JAK2/STAT3信號通路而促進腫瘤相關成纖維細胞的形成[18]，肝細胞癌衍生的外泌體中miRNA-21 通過靶向PTEN從而激活PDK1/AKT 通路進而促進肝癌進展[19]。MiR-221激活A20/c-Rel/CTGF信號通路而促進腫瘤相關成纖維細胞形成[8]，但是miR-221 以及外泌體miR-221對胃癌腫瘤相關成纖維細胞的影響尚未見相關研究。

腫瘤細胞外囊泡通過誘導腫瘤相關成纖維細胞中的趨化因子促進基質異質性[20]，胃癌外泌體miR-27a促進成纖維細胞向腫瘤相關成纖維細胞的轉化[21]。本研究發現，胃癌細胞MGC-803 exo 和MKN45 exo 可促進腫瘤相關成纖維細胞的標志物MMP-9、α-SMA、Fibronectin、Vimentin 表達，以及特異性細胞因子IL-1β 和IL-6 的表達，說明胃癌外泌體具有調控腫瘤相關成纖維細胞的形成。

MiR-221可通過激活Wnt/β-catenin信號通路而促進三陰性乳腺癌的發展[22]，miR-221 可靶向抑制SOCS3 而影響胃癌的增殖和凋亡[23]。本研究發現，miR-221在胃癌細胞MGC-803和MKN45及其外泌體中高表達，外泌體miR-221 可促進腫瘤相關成纖維細胞的標志物MMP-9、α-SMA、Fibronectin、Vimentin 表達，以及特異性細胞因子IL-1β 和IL-6 的表達，即促進腫瘤相關成纖維細胞的形成。

MiR-221 可靶向PTEN/PI3K/AKT 信號通路而影響卵巢癌的化療耐藥[24]，miR-221也可靶向PTEN而誘導骨肉瘤的生長和轉移[25]，PTEN 亦可抑制腫瘤相關成纖維細胞的形成[26]，肝癌外泌體通過抑制PTEN的表達而促進肝形狀細胞向腫瘤相關成纖維細胞的轉化[19]。MiRNA 的調控機制是結合與其靶基因mRNA 的3'UTR 區域，而抑制靶基因的翻譯。本文通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證了miR-221可靶向結合PTEN mRNA，PTEN為miR-221的靶基因，并且外泌體miR-221可抑制PTEN的表達，HKF細胞與miR-221exo 孵育后轉染PTEN 質粒，其腫瘤相關成纖維細胞的標志物MMP-9、α-SMA、Fibronectin、Vimentin表達，以及特異性細胞因子IL-1β和IL-6的表達均顯著低于miR-221 exo組，進一步證明了外泌體miR-221是通過靶向PTEN而促進腫瘤相關成纖維細胞的形成。

綜上所述，胃癌外泌體中miR-221 可通過抑制PTEN 的表達而促進腫瘤相關成纖維細胞的生成，為胃癌發病機制的探究提供了一定的理論依據，但是本文尚存在一定的局限性，并未進一步探究誘導后的腫瘤相關成纖維細胞對胃癌的影響。已有研究表明，外泌體miR-1247-3p 誘導的腫瘤相關成纖維細胞可促進肺癌的轉移[27]，乳腺癌外泌體miR-146a 可誘導腫瘤相關成纖維細胞的形成而促進乳腺癌的遷移和侵襲[28]，因此，本研究將胃癌外泌體miR-221誘導的腫瘤相關成纖維細胞對胃癌轉移的影響作為后續的研究方向。