胃癌干細(xì)胞疫苗在小鼠胃癌模型中的抗腫瘤功能研究*

孟 濤，曾祥岳，金 博

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科,烏魯木齊 830011）

胃癌在中國(guó)胃腸道腫瘤中排名第一，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1-2]。目前，手術(shù)仍是早期胃癌患者的主要治療方法[3]。但是，胃癌的早期診斷率很低，大多數(shù)患者在被診斷時(shí)已經(jīng)處于中晚期，目前針對(duì)中晚期胃癌患者的治療仍然沒(méi)有取得明顯的進(jìn)展[4-5]。因此，探索新型胃癌治療手段仍然是胃癌治療中需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。眾所周知，胃癌干細(xì)胞（GCSC）具有自我更新能力，還有致瘤性和驅(qū)動(dòng)耐藥性的特征[6-7]，并且可能具有驅(qū)動(dòng)腫瘤異質(zhì)性和腫瘤生長(zhǎng)的功能[8]。GCSC 不僅負(fù)責(zé)免疫逃逸，而且還負(fù)責(zé)免疫抑制，維持與腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞生長(zhǎng)以抑制免疫介導(dǎo)的腫瘤清除[9]。目前，已確定了幾種分子作為GCSC的標(biāo)志物，包括Lgr5、CD44、CD133、醛脫氫酶（ALDH）等[10]。靶向消除GCSC被認(rèn)為是一種非常有前景的胃癌治療方向[11]。先前有研究表明，基于腫瘤干細(xì)胞裂解物的疫苗可以提供大量腫瘤特異性抗原，刺激免疫細(xì)胞的增殖和分化，并克服癌癥疫苗弱免疫原性的缺陷[12]。本研究旨在構(gòu)建針對(duì)胃癌干細(xì)胞的腫瘤疫苗，探索其是否可以引發(fā)足夠的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而抑制體內(nèi)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

小鼠胃癌細(xì)胞系MFC 細(xì)胞及小鼠淋巴瘤細(xì)胞系YAC-1 購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司。兩種細(xì)胞系均用Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺。

表皮生長(zhǎng)因子和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，購(gòu)自北京義翹神州生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒，購(gòu)自南京翼雪飛生物科技有限公司；cDNA 逆轉(zhuǎn)試劑盒和SYBR Green Mix，購(gòu)自上海翌圣生物科技有限公司；小鼠自然殺傷細(xì)胞（NK 細(xì)胞）分離試劑盒和小鼠細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTL）分離試劑盒，購(gòu)自STEM CELL公司（加拿大）；紅細(xì)胞裂解液、羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（CFSE）、7AAD，購(gòu)自Ivitrogen公司（美國(guó)）；兔抗鼠GzmB抗體和兔抗鼠Perforin抗體，購(gòu)自Abcam 公司（美國(guó)）；山羊抗兔HRP 偶聯(lián)二抗、白介素（IL）-1β、IL-2、IL-4 和IL-12 ELISA 檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自杭州聯(lián)科生物科技有限公司。

1.2 胃癌干細(xì)胞的富集

將約2×105MFC 細(xì)胞接種到超低吸附6 孔板（Corning，美國(guó)）中，培養(yǎng)基選擇為無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基，額外添加20 μg/L表皮生長(zhǎng)因子，20 μg/L成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和1%青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺，在5%CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d 后，收集腫瘤球，即為胃癌干細(xì)胞，其他未形成小球的細(xì)胞用胰酶消化收集，即為普通腫瘤細(xì)胞。

1.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將約500 個(gè)單細(xì)胞接種在6 孔板中，添加2 mL培養(yǎng)基，然后在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在第14 天使用0.1%結(jié)晶紫溶液在室溫下避光染色30 min，用冷PBS沖洗3次后風(fēng)干，對(duì)菌落數(shù)進(jìn)行記數(shù)。

1.4 qPCR檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)

使用RNA 提取試劑盒提取總RNA 用于qPCR。根據(jù)制造商的方案，使用cDNA逆轉(zhuǎn)試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，之后使用qPCR SYBR Green Mix進(jìn)行qPCR。qPCR 在Step One Plus 實(shí)時(shí)系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國(guó)）上進(jìn)行。循環(huán)條件為：95 ℃初始熱活化2 min，2 步循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃退火/延伸10 s。循環(huán)數(shù)為40。倍數(shù)變化值的計(jì)算公式為2-ΔΔCt。引物為：CD44（F:5′-CGTGCTGGGAGGCAGAATA-3′,R:5′-GGGCATCCTTGGTCTGTTTG-3′）,Lgr5（F:5′-CTGGCAGTGGAAGCGTCATA-3′,R:5′-TCTCTGTTTTCATTAGCAGAGACAT-3′）,GAPDH（F:5′-GCCTTCCGTGTTCCTACC-3′,R:5′-GCCTGCTTCACCACCTTC-3′）。引物由安徽通用生物合成。

1.5 GCSC 疫苗免疫小鼠模型檢測(cè)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制能力

18只6周齡的雌性Balb/c小鼠購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有小鼠均按照我院倫理學(xué)的規(guī)章飼養(yǎng)在特定的無(wú)病原體設(shè)施中。實(shí)驗(yàn)組包括PBS 組、WT 疫苗組、GCSC 疫苗組。疫苗是通過(guò)反復(fù)凍融法制備，將2×105GCSC 或WT cell 于-80 ℃冷凍30 min，并于37 ℃解凍30 min，重復(fù)3次。之后所有小鼠均在右側(cè)腹部皮下免疫2×105個(gè)疫苗細(xì)胞，共進(jìn)行3 次，每次間隔7 d。最終疫苗接種后1周，皮下注射2×106個(gè)野生型MFC細(xì)胞。每5 d監(jiān)測(cè)1 次小鼠的腫瘤體積。腫瘤體積計(jì)算為（長(zhǎng)×寬×高/2）mm3。

1.6 流式檢測(cè)NK細(xì)胞和CTL的細(xì)胞毒性

在疫苗免疫后的第35 天，獲取小鼠脾臟，分離小鼠脾細(xì)胞，并用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞。脾細(xì)胞使用5 μmol/L CFSE 在37 ℃孵育30 min，之后用預(yù)冷的PBS 終止。按照制造商的說(shuō)明，使用小鼠NK細(xì)胞分離試劑盒和小鼠CTL分離試劑盒獲取小鼠的NK 細(xì)胞和CTL。分別取5×105個(gè)NK 細(xì)胞或CTL與1×105YAC-1細(xì)胞在37 ℃下共孵育24 h。收集YAC-1 細(xì)胞并用PBS 洗滌3 次。隨后，所有樣品在室溫下用7AAD 染色15 min。通過(guò)流式細(xì)胞儀（貝克曼，美國(guó)）分析樣品，并使用FlowJo X 軟件進(jìn)行分析。

1.7 ELISA檢測(cè)血清中IL-1β、IL-2、IL-4和IL-12的含量

在疫苗免疫后的第35 天，獲取小鼠血清200 μL。根據(jù)制造商的方案，使用IL-1β、IL-2、IL-4 和IL-12 ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清中細(xì)胞因子的含量。

1.8 免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中GzmB和Perforin的含量

腫瘤組織在4%多聚甲醛中固定48 h，并儲(chǔ)存在70%乙醇中，直到進(jìn)一步處理。IHC 由武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司操作。5 mm石蠟切片在5%山羊血清中封閉1 h，使用兔抗鼠GzmB 抗體（1∶500）和兔抗鼠Perforin（1∶500）抗體在4 ℃下孵育過(guò)夜，之后使用山羊抗兔HRP 偶聯(lián)二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h。DAB 顯色后用蘇木精復(fù)染2 min，使用Nanosomer2.0HT 數(shù)字載玻片掃描儀和NDP.view2 軟件（Hamamatsu）獲得圖像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鑒定胃癌干細(xì)胞的特征

克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，GCSC 較WT cell會(huì)形成更多的克隆小球（P＜0.05）（圖1A、B）。qPCR 結(jié)果顯示，GCSC 中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD44 和Lgr5 的表達(dá)量較WT cell 明顯升高（P＜0.001，P＜0.01）（圖1C、D）。

圖1 鑒定GCSC特征

2.2 GCSC疫苗抑制小鼠胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)

經(jīng)過(guò)3次疫苗免疫后，對(duì)小鼠皮下接種MFC細(xì)胞（圖2A）。結(jié)果顯示，GCSC 疫苗較WT 疫苗更能顯著抑制小鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)（P＜0.05）（圖2B）。對(duì)解剖后的腫瘤進(jìn)行拍照稱重，結(jié)果也表明，GCSC疫苗組的腫瘤質(zhì)量顯著低于WT 疫苗組（P＜0.000 1）（圖2C、D）。

圖2 GCSC疫苗的腫瘤抑制能力

2.3 GCSC疫苗增強(qiáng)NK細(xì)胞和CTL的細(xì)胞毒性

流式檢測(cè)結(jié)果顯示，GCSC疫苗組小鼠NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性顯著強(qiáng)于WT 疫苗組和PBS 組（P＜0.05）（圖3A、B）。與PBS 組比較，GCSC 疫苗組小鼠CTL的細(xì)胞毒性也顯著升高（P＜0.05）（圖3C、D）。

2.4 GCSC 疫苗提高免疫小鼠外周血中細(xì)胞因子的水平

ELISA 檢測(cè)小鼠血清中細(xì)胞因子的含量，結(jié)果表明，GCSC 疫苗組小鼠血清中IL-4、IL-2 和IL-12水平較WT疫苗組和PBS組顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）（圖4B、C、D），而IL-1β的含量在3組小鼠中無(wú)顯著差異（P＞0.05）（圖4A）。

圖4 GCSC疫苗誘導(dǎo)的血清中的炎性因子

2.5 GCSC疫苗顯著提高腫瘤組織中GzmB和Perforin的含量

免疫組化結(jié)果顯示，GCSC 疫苗組小鼠腫瘤組織中GzmB 和Perforin 的表達(dá)水平較WT 疫苗組和PBS 組顯著升高（P＜0.000 1），表明其具備更強(qiáng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，見(jiàn)圖5。

圖5 GCSC疫苗在腫瘤組織中誘導(dǎo)的GzmB和穿孔素表達(dá)

3 討論

胃癌的高復(fù)發(fā)率和高死亡率問(wèn)題仍未解決，這可能與胃癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性密切相關(guān)[13]。因此，胃癌干細(xì)胞被認(rèn)為是非常有希望的治療靶標(biāo)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，疫苗可以作為靶向清除腫瘤干細(xì)胞的有效策略，這主要是通過(guò)提供足量的腫瘤特異性抗原，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的[14]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)GCSC 疫苗通過(guò)對(duì)胃癌干細(xì)胞的靶向殺傷作用顯著降低腫瘤的生長(zhǎng)。

目前常用的癌癥疫苗包括腫瘤裂解物、腫瘤相關(guān)抗原多肽疫苗以及樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗[15]。已經(jīng)證明，與腫瘤相關(guān)抗原多肽疫苗相比，整個(gè)腫瘤細(xì)胞的裂解物是一種更好的抗原來(lái)源，能夠誘導(dǎo)更加充分的抗腫瘤免疫反應(yīng)[16]。有多種制備腫瘤細(xì)胞裂解物的方法，包括凍融、加熱、次氯酸氧化和UVB 照射[17]。凍融方法可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死，增加腫瘤抗原的釋放[18]，因此本研究也采用了凍融法制備胃癌干細(xì)胞疫苗。Ning 等[19]揭示基于腫瘤干細(xì)胞裂解物的疫苗可以在黑色素瘤小鼠模型中誘發(fā)產(chǎn)生IgG 抗體和特異性細(xì)胞毒性T 細(xì)胞。同樣，在本研究中也發(fā)現(xiàn)，注射GCSC 疫苗的小鼠中，NK 細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的殺傷能力顯著增強(qiáng)，同時(shí)，體內(nèi)細(xì)胞因子IL-2，IL-4 及IL-12 的含量明顯增加，這些都表明GCSC疫苗有效的引發(fā)了小鼠體內(nèi)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。Todaro等[20]先前的報(bào)道發(fā)現(xiàn)，CD133+結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞可以被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞通過(guò)穿孔素和顆粒酶殺死，在本研究中，給予GCSC疫苗干預(yù)的小鼠腫瘤組織中GmzB 和Perforin 的含量顯著高于PBS 組，這也證明了GCSC 疫苗引發(fā)了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

有研究結(jié)果表明，腫瘤干細(xì)胞DC疫苗在SCC7鱗狀細(xì)胞癌和D5黑色素瘤小鼠模型中均顯著抑制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，使用抗PD-1抗體可以增強(qiáng)疫苗的功效[21]。這提示我們可以在接下來(lái)的研究中，評(píng)估胃癌干細(xì)胞DC疫苗是否具有更好的功效，同時(shí)，聯(lián)合PD-1 抗體來(lái)增強(qiáng)療效也將是不錯(cuò)的選擇。除此以外，本研究并未探索GCSC疫苗的體內(nèi)毒性，這會(huì)在今后的研究中進(jìn)行系統(tǒng)的毒理學(xué)研究，以期更好的評(píng)估該療法的臨床應(yīng)用的潛力。

總之，本研究檢測(cè)了預(yù)防性GCSC疫苗在MFC小鼠模型中誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，結(jié)果表明，GCSC 疫苗可以激發(fā)小鼠的抗腫瘤免疫應(yīng)答，增強(qiáng)NK細(xì)胞及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，提升機(jī)體細(xì)胞因子的分泌水平，抑制胃癌細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)。這些結(jié)果支持對(duì)GCSC疫苗是否可以作為治療性癌癥疫苗的進(jìn)一步評(píng)估，同時(shí)也表明其在胃癌治療中的具有非常誘人的前景。