基于PSMA3-AS1研究黑加侖提取物對肺癌細胞周期、凋亡和遷移的影響*

俞 杰，陳衛榮，黃 勇

（江蘇省南通市海門區人民醫院胸外科，南通 226100）

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年升高趨勢[1]。放療和化療是晚期肺癌患者的常用治療方法，但毒副作用大，長期使用易使腫瘤細胞產生抗性，限制了其在臨床中的應用[2]。因此，亟需尋找新的副作用小的治療肺癌的藥物。黑加侖是虎耳草科茶藤屬植物黑醋栗的漿果，富含維生素、多酚、酚酸等多種生物活性成分，具有抗氧化、降血壓、抗腫瘤等功效[3-4]。研究顯示，黑加侖水提物可通過誘導細胞凋亡來抑制人食管癌細胞株Eca109細胞的生長[5]。但目前尚無黑加侖提取物影響肺癌細胞惡性生物學行為的相關報道。

PSMA3基因的反義RNA1（PSMA3-AS1）是一種長鏈非編碼RNA（lncRNA），其在肺癌組織和細胞系中的表達升高。PSMA3-AS1 高表達與肺癌患者臨床分期、轉移及預后不良密切相關，敲低PSMA3-AS1 可降低肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[6]。因此，本研究旨在探究黑加侖提取物對肺癌細胞A549細胞周期、凋亡和遷移的影響及其對PSMA3-AS1的調控作用，為其新藥研發和臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 肺癌細胞系A549（中國科學院上海細胞庫）。胎牛血清（FBS，浙江天杭生物公司）；RPMI 1640 培養基、細胞周期檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒和BCA 蛋白檢測試劑盒（北京索萊寶）；LipofectamineTM2000 試劑盒（美國Invitrogen 公司）；PSMA3-AS1 過表達載體（pcDNA-PSMA3-AS1）、空載體（pcDNA）和PCR 引物（上海生工）；兔抗人Bcl-2、Bax 和GAPDH 抗體（美國Santa Cruz 公司）；Trizol 試劑、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒（大連寶生物）。

1.2 黑加侖提取物的制備 黑加侖干燥，粉碎后，過100 目篩。準確稱取200 g 干燥粉末，以1∶10（g/mL）加70%乙醇，進行超聲提取。超聲條件：功率30 kW，溫度37 ℃，提取時間30 min，提取2次，抽濾，合并濾液。旋轉濃縮至10 mL 左右，冷凍干燥。制備100 mg/mL母液，過濾除菌后置于-20 ℃冰箱中保存，使用時用培養基稀釋至所需濃度。

1.3 細胞培養和轉染 用含10% FBS 的RPMI 1640 培養基培養A549 細胞。將對數期A549 細胞接種于6 孔板中（5.0×105個/孔），用LipofectamineTM2000 脂質體法，分別轉染pcDNA-PSMA3-AS1、pcDNA。轉染6 h 后，更換培養基。再培養24 h，收集細胞用于后續實驗。

1.4 細胞分組和處理 將A549細胞分為對照組和不同濃度黑加侖提取物組，其中對照組細胞用含10%FBS 的RPMI 1640 培養基培養，不同濃度黑加侖提取物組細胞分別用含5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL[7]黑加侖提取物的培養基培養。

轉染pcDNA-PSMA3-AS1、pcDNA 的A549 細胞用含10%FBS 的RPMI 1640 培養基培養，分別記為pcDNA-PSMA3-AS1 組、pcDNA 組。轉染pcDNA-PSMA3-AS1、pcDNA 的A549 細胞用含15 mg/mL黑加侖提取物的培養基培養，并分別記為15 mg/mL 黑加侖提取物+pcDNA-PSMA3-AS1 組、15 mg/mL黑加侖提取物+pcDNA組。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡 將A549細胞接種于24 孔板中（5.0×104個/孔），按不同分組處理細胞，培養24 h 后，收集細胞。（1）PBS 清洗細胞2次，加入1 mL 70%乙醇，混勻，4 ℃固定12 h；1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加1 mL PBS，重懸細胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；加入0.5 mL PI 溶液室溫下避光染色30 min，上流式細胞儀檢測細胞周期。（2）調整細胞密度為5.0×105個/mL，PBS 清洗細胞2 次，1 000 r/min離心5 min，棄上清；加入500 μL結合緩沖液，重懸細胞；加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫下避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6 劃痕實驗檢測細胞遷移 將A549細胞接種于24 孔板中（5.0×104個/孔），用200 μL 微量吸液槍頭沿板中軸在單層細胞劃痕。PBS 洗去劃掉細胞，測定劃痕間寬度，記為0 h 寬度。按不同分組處理細胞，培養24 h 后，再次測量寬度，記為24 h 寬度，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（0 h寬度-24 h寬度）/0 h寬度×100%。

1.7 Western blotting 法檢測細胞Bcl-2 和Bax 蛋 白表達 用RIPA 試劑提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白含量；SDS-PAGE電泳分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF膜，封閉，加入一抗Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）4 ℃孵育過夜；洗膜，山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫下孵育1 h；洗膜，加顯影液避光顯影，曝光，拍照。采用Image J 軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.8 RT-qPCR 法檢測PSMA3-AS1 mRNA 相對表達量 用Trizol 試劑提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，在T100 型PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）上進行PCR 擴增。PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環。引物序列如下：PSMA3-AS1 上游：5'-AACAGACCATCAGAAGAGAACA-3'，下 游：5'-GAACAGAAACCAGAGCCATACA-3'；GAPDH 上游：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3'，下游：5'-GGAAGATGGTGATGGGATTT-3'。用2-△△Ct法計算PSMA3-AS1 mRNA相對表達量。

1.9 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件分析實驗數據。計量資料以均數±標準差（）表示。多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黑加侖提取物對A549細胞周期的影響 與對照組比較，10 mg/mL、15 mg/mL 黑加侖提取物組A549 細胞周期G0～G1 期延長，S 期縮短（均P＜0.05），而G2～M期無明顯差異（P＞0.05）；5 mg/mL黑加侖提取物組與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；隨著黑加侖提取物濃度的增加，G0～G1期延長，S期縮短（均P＜0.05），而G2～M期組間無明顯差異（P＞0.05），見圖1。

圖1 4組A549細胞周期的比較

2.2 黑加侖提取物對A549 細胞凋亡和遷移的影響 與對照組比較，10 mg/mL、15 mg/mL 黑加侖提取物組A549 細胞凋亡率升高，劃痕愈合率降低，Bax 蛋白表達升高，Bcl-2 蛋白表達降低（均P＜0.05），而5 mg/mL黑加侖提取物組各檢測指標均無明顯差異（P＞0.05），不同濃度黑加侖提取物組間各檢測指標兩兩比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2 4組A549細胞凋亡率、凋亡相關蛋白表達及細胞遷移能力的比較

2.3 黑加侖提取物對A549 細胞中PSMA3-AS1 表達的影響 對照組和5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL黑加侖提取物組A549 細胞中PSMA3-AS1 表達分別為1.00±0.00、0.97±0.05、0.68±0.04 和0.29±0.02（F=290.222，P＜0.05），與對照組比較，10 mg/mL、15 mg/mL 黑加侖提取物組A549 細胞中PSMA3-AS1表達顯著降低（P＜0.05），而5 mg/mL黑加侖提取物組PSMA3-AS1 表達無明顯差異（P＞0.05），不同濃度黑加侖提取物組間PSMA3-AS1表達兩兩比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

2.4 過表達PSMA3-AS1 對黑加侖提取物處理的A549 細胞周期及PSMA3-AS1 表達的影響 與pcDNA組比較，15 mg/mL黑加侖提取物+pcDNA組A549細胞中PSMA3-AS1表達降低，A549細胞周期G0～G1 期延長，S 期縮短（均P＜0.05），G2～M 期無明顯差異（P＞0.05），而pcDNA-PSMA3-AS1 組A549細胞中PSMA3-AS1表達升高（P＜0.05），細胞周期G0～G1 期縮短，S 期延長（均P＜0.05），G2～M 期無明顯差異（P＞0.05）。與pcDNA-PSMA3-AS1 組比較，15 mg/mL 黑加侖提取物+pcDNA-PSMA3-AS1組A549細胞中PSMA3-AS1表達降低，細胞周期G0～G1 期延長，S 期縮短（均P＜0.05），而G2～M 期無明顯差異（P＞0.05）。與15 mg/mL 黑加侖提取物+pcDNA組比較，15 mg/mL黑加侖提取物+pcDNA-PSMA3-AS1 組A549 細胞中PSMA3-AS1 表達升高，細胞周期G0～G1 期縮短，S 期延長（均P＜0.05），而G2～M 期無明顯差異（P＞0.05），見圖3。

圖3 過表達PSMA3-AS1對黑加侖提取物處理的A549細胞周期及PSMA3-AS1表達的影響

2.5 過表達PSMA3-AS1 對黑加侖提取物處理的A549 細胞凋亡和遷移的影響 與pcDNA 組比較，15 mg/mL黑加侖提取物+pcDNA組A549細胞凋亡率升高，劃痕愈合率降低，Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低（均P＜0.05），而pcDNA-PSMA3-AS1組A549 細胞凋亡率降低，劃痕愈合率升高，Bax 蛋白表達降低，Bcl-2 蛋白表達升高（均P＜0.05）。與pcDNA-PSMA3-AS1組比較，15 mg/mL黑加侖提取物+pcDNA-PSMA3-AS1 組A549 細胞凋亡率升高，劃痕愈合率降低，Bax 蛋白表達升高，Bcl-2 蛋白表達降低（均P＜0.05）。與15 mg/mL 黑加侖提取物+pcDNA 組比較，15 mg/mL 黑加侖提取物+pcDNAPSMA3-AS1 組A549 細胞凋亡率降低，劃痕愈合率升高，Bax 蛋白表達降低，Bcl-2 蛋白表達升高（均P＜0.05），見圖4。

圖4 過表達PSMA3-AS1對黑加侖提取物處理的A549細胞遷移及凋亡的影響

3 討論

黑加侖含有維生素、有機酸、多酚和礦物質等多種營養物質，是天然的保健食品。有報道稱，1 mg/mL 的黑加侖提取物可抑制肝癌細胞QCY-7704 生長[8]。本研究結果顯示，10 mg/mL、15 mg/mL 的黑加侖提取物可明顯阻滯肺癌細胞周期進程，促進肺癌細胞凋亡，并抑制肺癌細胞遷移，說明黑加侖提取物可抑制肺癌細胞的惡性生物學行為，發揮一定的抗肺癌作用，具有治療肺癌的潛在價值。細胞凋亡是一種程序性死亡過程，受多種基因的調控。Bax/Bcl-2是細胞凋亡的重要調控分子，其中Bax表達上調誘導細胞凋亡，而Bcl-2表達下調時則對細胞凋亡起抑制作用[9]。本研究發現，黑加侖提取物劑呈劑量依賴性地降低A549細胞中Bcl-2蛋白的表達，而促進了Bax蛋白的表達，進一步從蛋白水平說明黑加侖提取物可誘導肺癌細胞凋亡。

作為一種lncRNA，PSMA3-AS1 參與多種腫瘤的發展。研究顯示，食管鱗狀細胞癌（ESCC）組織中PSMA3-AS1表達明顯上調，其高表達與ESCC患者腫瘤大小、遠處轉移和不良預后密切相關，過表達PSMA3-AS1 通過靶向調控miR-101/EZH2 軸促進體外ESCC 細胞增殖、侵襲和遷移，其可能為ESCC的治療提供新的分子靶點[10]。干擾PSMA3-AS1表達可有效提高多發性骨髓瘤異種移植瘤對卡非佐米的敏感性[11]。敲低PSMA3-AS1 可靶向miR-302a-3p 抑制RAB22A 的表達，在體內、體外降低神經膠質瘤細胞遷移、增殖和侵襲能力，表明PSMA3-AS1 可作為神經膠質瘤的治療和預后潛在靶標[12]。PSMA3-AS1可靶向miR-409-3p促進非小細胞肺癌細胞的侵襲性[13]。本研究結果顯示，過表達PSMA3-AS1可加速肺癌細胞周期進程，促進肺癌細胞遷移，并阻礙肺癌細胞凋亡，提示PSMA3-AS1對肺癌的發展起促進作用，其有可能成為肺癌治療的分子靶點；黑加侖提取物可劑量依賴性地降低肺癌細胞中PSMA3-AS1的表達，而過表達PSMA3-AS1逆轉了黑加侖提取物對肺癌細胞的細胞周期、遷移及凋亡的影響。提示黑加侖提取物可能通過下調PSMA3-AS1表達來抑制肺癌細胞的惡性生物學行為。

綜上所述，黑加侖提取物可有效阻滯肺癌細胞周期進程，抑制細胞遷移，并促進細胞凋亡，其可能通過下調PSMA3-AS1表達發揮作用。本組將進一步探究黑加侖提取物抗肺癌的作用機制，并通過裸鼠移植瘤實驗驗證其作用。