高效液相色譜-串聯質譜法測定中華絨螯蟹中β-受體激動劑西馬特羅殘留量

◎ 劉 真，王玉梅

（南京市食品藥品監督檢驗院，江蘇 南京 211198）

β-受體激動劑（β-興奮劑）屬于腎上腺類神經興奮劑，早期用于治療哮喘，可有效松弛支氣管平滑肌，在獸藥治療領域發揮一定作用[1]。由于其作為飼料添加劑應用在羊、肉雞和豬等的養殖中能夠減少動物脂肪的產生，增加肌肉蛋白含量[2-3]，而被錯誤地應用于動物養殖中，俗稱“瘦肉精”，導致一系列因食用含有β-受體激動劑的食物而引起的中毒事件。目前，我國農業農村部公告第250號明確規定β-興奮劑（β-agonists）及其鹽、酯為食用動物中禁止使用的藥品[4]。西馬特羅（Cimaterol）屬于一種新一代的β-受體激動劑，2015年原國家食藥監總局發布的65批次食品不合格通告中就有一批豬后臀尖檢出禁用藥物西馬特羅。如果長期食用含有西馬特羅的動物源性食品，將會損害身體健康甚至危及生命。

目前，西馬特羅的檢測方法研究主要集中在豬、牛、羊等畜肉產品上。肖雄楓等利用表面增強拉曼技術快速檢測新鮮豬肉中的β-受體激動劑含量（包括西馬特羅），檢出限為0.005 μg·g-1[5]。張燕等利用酶聯免疫分析方法測定了動物源性食品（豬肉、雞肉及牛肉樣品）中西馬特羅殘留量，檢出限為0.09 μg·L-1[6]。張連明等構建了一種DNA輔助識別的西馬特羅分子印跡傳感器用于豬肉樣品中西馬特羅的檢測，檢出限為3.2×10-14mol·L-1[7]。LIU等用新型分子印跡聚合物萃取法結合液相色譜-串聯質譜儀對豬肉組織中的β-受體激動劑進行靈敏檢測，檢出限小于0.02 μg·kg-1[8]，但是針對中華絨螯蟹這一基質類型中西馬特羅的檢測分析研究較少。本文建立了一種用于針對中華絨螯蟹中β-受體激動劑西馬特羅殘留量的高效液相色譜-串聯質譜法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測方法，并利用該方法對市售實際樣品進行了風險監測，積累了其西馬特羅殘留量的數據，為進一步加強中華絨螯蟹安全監管提供了一定的技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與標準品

液相色譜-串聯質譜聯用儀（Aglient 1290-6470 HPLC-MS/MS）：配有電噴霧離子源（ESI）；pH計（梅特勒-托利多）；渦旋振蕩器（Thermo Fisher）；離心機（Thermo Fisher LYNX 4000）；固相萃取柱過柱裝置（CNW 24位）；氮吹儀（萊伯泰科 MV5）；振蕩水浴鍋（金壇精達 SHA-B）；0.22 μm有機系微孔濾膜（上海安譜實驗科技有限公司）；濾紙及玻璃漏斗。

0.2 mol·L-1乙酸鈉緩沖液：稱取13.6 g三水合乙酸鈉（分析純），溶解于500 mL水中，用適量乙酸調節pH值為5.2）。β-葡萄糖醛酸甙酶/芳基硫酸酯酶（≥10 000 units/mg）；5%氨水-甲醇溶液：移取50 mL氨水（分析純）于1 L容量瓶中，用甲醇（色譜級）定容至刻度，混勻）。SCX強陽離子交換柱（月旭科技，500 mg/6 mL。甲醇（色譜級）；0.1 mmol·L-1高氯酸-水溶液（準確移取8.7 μL高氯酸，用水稀釋至1 L容量瓶中）；標準品：西馬特羅標準品（CAS：54239-37-1）、克倫特羅-D9標準品（CAS：129138-58-5）、沙丁胺醇-D3標準品（CAS：1219798-60-3），均購自天津阿爾塔公司。

1.2 樣品提取

1.2.1 提取

稱量2 g（精確到0.01 g）均質的中華絨螯蟹樣品（僅均質肉及性腺）于50 mL離心管中，加入20 mL 0.2 mol·L-1的乙酸鈉緩沖液及20 ng克倫特羅-D9內標溶液（即200 μL 100 ng/mL的克倫特羅-D9內標溶液）后充分渦旋混勻，加入β-葡萄糖醛酸甙酶/芳基硫酸酯酶50 μL，于37 ℃下過夜酶解（16 h），酶解液在10 000 r·min-1轉速下離心3 min，經濾紙過濾后，定量移取10 mL濾液待凈化。

1.2.2 凈化

SCX凈化柱依次經6 mL 5%氨水-甲醇溶液、6 mL甲醇、6 mL水、6 mL 0.1 mmol·L-1高氯酸-水溶液活化，將上述10 mL待凈化濾液上柱凈化，依次用2 mL甲醇及2 mL水分別淋洗，并徹底抽干小柱，最后用6 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脫待測物，接收洗脫液，在40 ℃水浴下氮氣吹干，定容至1 mL 10%甲醇-水溶液中，渦旋混勻，經0.22 μm有機濾膜過濾后經液相色譜-串聯質譜儀上機測定，內標法定量。

1.3 HPLC-MS/MS分析

1.3.1 色譜條件

色 譜 柱：Aglient Exlipse C18色 譜 柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；進樣體積：1 μL；流速：0.3 mL·min-1；色譜柱溫：40 ℃；流動相：A（0.1%甲酸-水溶液）、B（甲醇）；流動相梯度洗脫程序為0～1 min，95%～75%A；1～2 min，75%～60%A；2～3 min，60%～95%A；3～5 min，95%A。

1.3.2 質譜條件

干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：11 L·min-1；霧化氣壓力：35 psi；鞘氣溫度：325 ℃；鞘氣流速：11 L·min-1；毛細管電壓：4 000 V；電離方式：正模式掃描（ESI+）；監測方式：多反應監測模式（MRM）；監測離子對：西馬特羅（219.8/202.0、219.8/159.7、219.8/143.1、219.8/116.1），克倫特羅-D9（286/204.1、286/133.1）。

1.4 數據處理

標準溶液及待測樣品溶液通過高效液相色譜-串聯質譜儀進行分離測定，以西馬特羅及內標克倫特羅-D9的濃度比值作為橫坐標，以西馬特羅及內標克倫特羅-D9的峰面積比值作為縱坐標繪制西馬特羅的定量標準曲線，利用該標準曲線對待測樣品溶液中的目標物質進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 定性及定量離子的確定

西馬特羅及克倫特羅-D9的結構式如圖1所示，西馬特羅及克倫特羅-D9的質量數分別為219.28及286.248。利用安捷倫液質聯用儀Optimizer軟件在ESI正模式條件下對兩種物質的離子對進行自動優化，得到表1所示定量離子對及定性離子對，其中西馬特羅選取了響應最佳的4對離子對，克倫特羅-D9選取了響應最佳的2對離子對，其中西馬特羅選取4對離子對，是為了避免實際樣品檢測中假陽性的出現，當實際樣品中4對離子對均出現，且保留時間及離子豐度比均與相當濃度的標準品出峰情況相符合時，才判定實際樣品中西馬特羅的陽性檢出。西馬特羅及克倫特羅-D9的質譜圖如圖2所示。

圖1 西馬特羅及克倫特羅-D9結構式圖

表1 西馬特羅及克倫特羅-D9監測離子對匯總表

圖2 西馬特羅及克倫特羅-D9質譜圖

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 提取試劑及凈化柱的選擇

由于β-受體激動劑類物質在動物源性食品中，易與動物體內某些成分，如葡萄糖醛苷酸、硫酸等結合成為非游離態，所以對中華絨螯蟹中西馬特羅進行提取時先進行酶解反應，利用β-葡萄糖醛酸甙酶/芳基硫酸酯酶將西馬特羅釋放為游離態，再進行凈化測定[9-10]。已有研究表明β-葡萄糖醛酸甙酶/芳基硫酸酯酶最佳使用的溫度為37 ℃，最佳pH值為5.2，因此本實驗參考已有文獻于37 ℃下酶解16 h，研究了用乙酸調節pH值為5.2的0.2 mol·L-1乙酸鈉-乙酸緩沖液及0.2 mol·L-1乙酸銨-乙酸緩沖液的提取效果，同時考察了兩款陽離子交換固相萃取柱（分別為強陽離子交換SCX固相萃取柱及混合型陽離子交換MCX固相萃取柱）的凈化效果，結果如圖3所示[9,11]。由圖3中柱狀圖可知，同樣的加標水平條件下，使用乙酸鈉緩沖液及SCX凈化柱時提取得到的目標物質響應最佳，且6次獨立重復性實驗之間平行性最好；圖3（a）是經過乙酸鈉緩沖液提取后，分別經MCX凈化柱及SCX凈化柱凈化后，1 mL10%甲醇-水溶液復溶后的溶液對比，可見SCX凈化后的復溶液為無色，凈化效果更好，結合圖3（b），本實驗選取乙酸鈉緩沖液作為提取試劑，選取SCX凈化柱進行凈化實驗。

圖3 提取試劑及凈化柱效果比對圖

此外，本實驗對是否使用β-葡萄糖醛酸甙酶/芳基硫酸酯酶對加標后的中華絨螯蟹樣品進行酶解的檢測結果進行了考察，兩組實驗加標量相同，均在37 ℃下孵育16 h，一組酶解，一組未加酶，上機后測定回收的西馬特羅峰面積，如圖4所示，酶解后目標物質響應更佳，且6次重復性實驗平行性更好。因此，本實驗決定在前處理過程中采取酶解方案。

圖4 酶解及未酶解條件下的西馬特羅峰面積對比圖

2.2.2 內標標準品的選擇

在β-受體激動劑的檢測中，最常使用的兩種內標分別是克倫特羅-D9及沙丁胺醇-D3[12]，本實驗研究了這兩種內標對定量結果的影響。如圖5所示，保持兩種內標在樣品復溶液中的濃度均為10 ng·mL-1，外標加標水平為5.0 μg·kg-1時，內標法定量結果遠比外標法要好，均大于80%，比較而言，選擇回收率效果更好的克倫特羅-D9作為內標使用。

圖5 兩種內標定量結果及外標法定量結果比較圖（n=6）

2.2.3 洗脫溶劑的選擇

由于西馬特羅目標物質是在偏酸性環境下與強陽離子交換凈化柱結合從而保留在凈化柱上，因此選取了堿性有機溶劑進行洗脫收集，本實驗研究了不同體積比的氨水-甲醇溶液對目標物質的洗脫效果。氨水-甲醇溶液的比例分別為甲醇、2%氨水-甲醇、5%氨水-甲醇、8%氨水-甲醇、10%氨水-甲醇、20%氨水-甲醇，對比了內標法（內標為克倫特羅-D9）定量方式下（加標濃度為7.968 ng·mL-1）不同洗脫溶劑的中華絨螯蟹中西馬特羅回收率情況，重復測定3次，結果如圖6所示。用內標法定量時，5%比例下洗脫效果最好，因此本實驗決定采用5%氨水-甲醇溶液進行洗脫。

圖6 內標法定量情況下不同體積比氨水-甲醇溶液洗脫效果圖

2.3 線性方程、測定低限及回收率、精密度

取適量西馬特羅（Cimaterol）標準溶液及克倫特羅-D9內標標準溶液配制標準工作曲線，結果表明，西馬特羅在0.498 0～199.200 0 ng·mL-1范圍內呈現良好的線性關系，見圖7，線性方程為y=2.760x+0.530 4，線性相關系數大于0.99，其中內標濃度均為10.00 ng·mL-1，測定低限為0.5 μg·kg-1，測定低限處西馬特羅信噪比大于10，滿足分析要求。

圖7 西馬特羅線性標準工作曲線圖

根據《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）附錄F檢測方法的確認要求，對食品中的禁用物質，回收率考察應在方法測定底限、2倍方法測定低限和10倍方法測定低限進行3水平試驗[13]。因此，針對農業農村部第250號公告中的禁用物質西馬特羅[4]，配制標準工作曲線濃度范圍為0.498～9.960 ng·mL-1，線性方程為y=2.786x+0.009 7（R＞0.99），進行了中華絨螯蟹基質中1倍（0.5 μg·kg-1）、2倍（1.0 μg·kg-1）、10倍（5.0 μg·kg-1）方法測定低限上的3水平6平行方法學考察，具體結果見表2。由表2可知，不同加標水平下的中華絨螯蟹基質中西馬特羅的回收率范圍為87.06%～94.10%，相對標準偏差范圍為1.92%～8.03%，表明所構建方法重復性好，回收率佳，可用于中華絨螯蟹中西馬特羅殘留量的準確定量分析。

表2 中華絨螯蟹基質中西馬特羅的平均回收率及相對標準偏差表

2.4 基質效應的影響

高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）具有選擇性高、靈敏度高，前處理方法多不需要衍生等優勢特點，但是HPLC-MS/MS對大多檢測物質而言具有一定的基質效應[14-15]，一般表現為較強的基質抑制效應，強基質效應會導致定量結果的偏離。本文采用文獻報道的基質效應計算方法[16]，計算公式為基質效應=(1-Am/A0)×100%，其中A0代表純溶劑中目標物質的峰面積，Am代表中華絨螯蟹樣品基質中同等濃度目標物質的峰面積，如果計算結果的絕對值大于50%，表明存在強基質效應；計算結果為負表明存在基質增強效應；計算結果為正表明存在基質抑制效應[12,17]。本實驗考察了中華絨螯蟹樣品中西馬特羅含量為10.0 μg·kg-1的基質效應，基質效應=(1-9 882/62 635)×100%=84.22%，表明中華絨螯蟹中西馬特羅的HPLC-MS/MS檢測存在很強的基質抑制效應，定量時需要采用內標法校正曲線或者基質匹配校正曲線修正定量結果，本實驗采用克倫特羅-D9內標法定量。

2.5 實際樣品的檢測

使用本實驗中的方法對江蘇省內各地湖區和市場隨機抽樣購買的57批次中華絨螯蟹樣品進行分析，發現57批次樣品中有3批次中檢出西馬特羅，檢出值質量濃度范圍為1.70～2.86 μg·kg-1，陽性檢出率為5.26%，表明市場中可能存在中華絨螯蟹養殖過程中西馬特羅違規使用的風險，需要引起重視和關注。

3 結語

本文研究了中華絨螯蟹中西馬特羅檢測的高效液相色譜-串聯質譜方法，通過過夜酶解和乙酸鈉-乙酸緩沖液提取目標物質，經強陽離子交換凈化柱凈化，氮吹復溶后上機，內標法定量。通過前處理條件的優化，線性關系、測定低限、回收率、精密度及基質效應的考察，建立了一種中華絨螯蟹中西馬特羅準確定量的HPLC-MS/MS方法，方法滿足檢測檢驗分析的要求。按照所構建方法對市場上57批次實際樣品進行檢測，發現3批次陽性風險樣品，檢出率為5.26%，含量為1.70～2.86 μg·kg-1，表明市售中華絨螯蟹存在西馬特羅違規使用的風險，應當引起關注。本方法的建立可用于中華絨螯蟹中β-受體激動劑西馬特羅的風險監測和數據積累分析，有利于進行相關的安全性評估。