枸杞中大腸菌群檢測不確定度的評定

◎ 于 倩，宋瑛瑛，宋雅蕓，劉興龍，羅清楠

（1.甘肅省分析測試中心，甘肅 蘭州 730000；2.酒泉職業技術學院，甘肅 酒泉 735000）

根據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》（GB 4789.3—2016）[1]的定義，大腸菌群是在一定培養條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般情況下，大腸菌群、菌落總數和霉菌等檢測項目是判斷食品衛生狀況的重要指標，而大腸菌群主要來自人畜糞便，作為糞便污染指標用來評價食品的衛生狀況，以其檢出情況可推斷出食品是否受到糞便污染[2]。為了確保大腸菌群檢驗結果的可信度，本文依據《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[3]以及《常用玻璃量》（JJG 196—2006）[4]對同一份枸杞樣品重復檢測30次，對影響大腸菌群測定不確定度來源進行分析，建立一種比較簡單的大腸菌群不確定度評定方法。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本試驗原材料為某公司生產且檢驗合格的同一批次枸杞，經過人工污染后成為本試驗樣品。

1.2 培養基與試劑

培養基月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose Broth，LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉湯由北京陸橋技術股份有限公司生產。氯化鈉（分析純）由天津市百世化工有限公司生產。

1.3 檢驗方法

依據GB 4789.3—2016第一法（大腸菌群稀釋培養計數法（Most Probable Number，MPN））進行檢驗，檢驗流程如下：無菌取樣25 g，加入225 mL生理鹽水，使用均質器拍打2 min，制成1∶10的樣品稀釋液，用1 mL無菌吸管吸取1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL生理鹽水的無菌試管中，在渦旋振蕩器上振蕩混勻制成1∶100的樣品稀釋液。以此類推，制成1∶1 000的樣品稀釋液。選擇1∶10、1∶100和1∶1 000這3個連續稀釋度的稀釋液，每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯，每管接種1 mL，（36±1）℃培養（24±2）h，觀察倒管內是否有氣泡產生，（24±2）h產氣者進行復發酵試驗（證實試驗），如未產氣則繼續培養至（48±2）h，產氣者進行復發酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。復發酵試驗是用接種環從產氣的LST肉湯管中分別取培養物1環，接種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，（36±1）℃培養（48±2）h，觀察產氣情況。產氣者計為大腸菌群陽性管。

1.4 檢驗結果判定

依據確證的大腸菌群BGLB陽性管數，檢索國標中MPN表（見附錄B），得到每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。

2 不確定度來源及評定

2.1 不確定度來源分析

本試驗操作嚴格按照GB 4789.3—2016第一法檢驗步驟執行，包括樣品稱量、稀釋、培養及結果修約等[5]。不確定因素主要包括重復檢測結果的不確定度樣品稱量過程的不確定度uc(樣)、倍數稀釋過程的不確定度uc(總稀釋)等[6]。本文對這些不確定度分別進行分析。

2.2 重復檢測引起的不確定度

標準不確定度為：

相對標準不確定度為：

2.3 稱樣引起的不確定度

無菌條件下，用最大量程為2 000 g、精度為0.1 g的電子天平稱取樣品25.0 g，依據電子天平檢定證書，在置信概率為95%時允許誤差為±0.1 g。

標準不確定度為：

相對標準不確定度為：

2.4 倍數稀釋過程引起不確定度

制成1∶10的樣品稀釋液時使用250 mL量筒，制成1∶100和1∶1000的樣品稀釋液時使用10 mL和1 mL玻璃移液管。按照檢定證書，在20 ℃時，250 mL量筒、10 mL移液管和1 mL移液管的容量允差分別為±2.0 mL、±0.05 mL和±0.015 mL，則它們的標準不確定度分別為：

相對標準不確定度分別為：

則倍數稀釋過程產生的相對標準不確定度為：

表1 單一樣品的重復檢測結果表

本次試驗最大稀釋倍數為1 000倍，則樣品總稀釋產生的相對標準不確定度為：

2.5 合成標準不確定度及擴展不確定度

合成標準不確定度為：u合=u總×1.321=0.033 041。

取置信概率p=95%，自由度v=30-1=29，由t分布表可查得k=2.045，則擴展不確定度U=2.045×0.033 041=0.067 569。

3 結論

除本文提到的3個方面的不確定因素外，還有其他因素，包括樣品保存條件、人員操作、培養溫度和時間等，考慮到這些方面對總不確定度的影響可以忽略不計。本次只考慮這3方面的不確定因素對枸杞中大腸菌群MPN法不確定度進行評估，結果表明，本實驗室重復檢測和倍數稀釋過程對不確定度影響較大，在以后的試驗中應加強控制。