應用高通量測序法分析延邊朝鮮族傳統發酵泡菜發酵初期微生物多樣性

◎ 劉麗宅，劉笑笑，白 實，金永梅，魏春雁，李 剛

（1.吉林省農業科學院，吉林 長春 130033；2.敦化市動物疫病預防控制中心，吉林 敦化 133799）

泡菜是我國傳統發酵食品，因其原輔料、發酵方式和區域的不同，泡菜中的核心菌群存在差異，從而影響其風味和質量[1]。研究泡菜中核心菌群具有重要的理論和實際意義[2-4]。延邊朝鮮族傳統發酵泡菜以動、植物性產品為原料，與韓國泡菜區別在于輔料中不添加魚子醬和蝦醬，而添加當地特產蘋果梨，該輔料的添加使朝鮮泡菜具有獨特的風味、富含活性乳酸菌，并增加了其營養價值[5-6]。

本研究采用高通量測序技術對延邊朝鮮族傳統發酵泡菜發酵初期微生物核心菌群進行分析，探討微生物多樣性，不僅可以保護我國傳統泡菜優良菌株資源，還可為傳統發酵泡菜工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

2020年6月4日采集延邊朝鮮族自治州8種發酵初期（第3 d）朝鮮族傳統發酵泡菜（1Y：櫻菜；2Y：蘇子葉；3Y：辣白菜；4Y：蘿卜塊；5Y：桔梗；6Y：海虹；7Y：牛板筋；8Y：牛筋片），無菌操作，裝入50 mL離心管，密閉用冰袋運到實驗室。

1.2 試劑

Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒，Life；2×Taq Master Mix，Vazyme；MagicPure Size Selection DNA Beads，Transgen；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit，OMEGA。

1.3 儀器與設備

電泳儀電源、電泳槽，北京市六一儀器廠；凝膠成像系統，美國UVP；Qubit? 3.0熒光計，Invitrogen；臺式離心機，Thermo Fisher；PCR儀，BIO-RAD；漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 總DNA提取

采取液氮研磨，按試劑盒要求提取。

1.4.2 PCR擴增

稀釋DNA作為模板，Illumina橋式PCR兼容引物進行PCR擴增。細菌16S rDNA V3-V4區：引物341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）；805R（GACTACHV GGGTATCTAATCC）。真菌18 rDNA V4區擴增區：引物18SV4F（GGCAAGTCTGGTGCCAG）；18SV4R（ACGGTATCTRATCRTCTTCG）。

PCR體 系：Bar-PCR Primer F 1 μL、2×Hieff?Robust PCR Master Mix 15 μL。PCR products 20 ng、Primer R 1 μL，用ddH20填充至30 μL。PCR條件：95 ℃，3 min；94 ℃，20 s；55 ℃，20 s；72 ℃，30 s；5次循環；72 ℃，5 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，根據其濃度等量混勻，用Qubit3.0 DNA試劑盒精確定量回收的DNA，量取10 ng，濃度為20 pmoL。

1.4.3 文庫構建和測序

采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil Kit建庫試劑盒構建文庫，Illumina MiSeq測序儀上機測序[7]。

2 結果與分析

2.1 細菌和真菌的序列豐度及多樣性分析

采用Illumina MiSeq平臺對8種發酵泡菜中的微生物進行高通量測序，獲得細菌和真菌序列。在閾值97%時，使用Chao1、Shannon、ACE和Simpson對單樣品進行統計分析，評估樣品中微生物群落的物種多樣性和豐富度。由表1可知，細菌有效序列591 061條，1 747個OTUs；真菌有效序列421 568條，443個OTUs，說明朝鮮族傳統發酵泡菜中細菌種類繁多、物種豐富。泡菜樣品6Y、7Y和8Y細菌的Shannon、ACE和Chao 1指數明顯高于其他5個樣品，說明樣品6Y、7Y和8Y的細菌物種豐度明顯高于其他5個樣品，且細菌群落結構比較復雜。

表1 泡菜中細菌和真菌測序數據統計表

2.2 稀釋曲線

稀疏曲線用來判斷測序數據量是否合理、測序深度是否可靠[8]。當稀釋曲線趨于平坦，表明測序深度合理，且產生更多的OTU。

從圖1可看出，各樣品的稀釋曲線在小于103 074序列的條件下均沒有進入平臺期，若繼續增加測序量，OTU數量也會隨著增加。4Y的測序量＞34 000序列時，1Y、2Y、3Y、5Y和6Y的測序量＞50 000序列時，7Y和8Y的測序量＞75 000序列時，基本滿足樣品中細菌群落多樣性。

圖1 細菌稀釋性曲線圖

從圖2可看出，當測序量較低時，隨著測序量增加，每個樣品的OTU數上升，但OTU數上升逐漸緩慢。當4Y的測序量＞21 800序列時，1Y、2Y、3Y、5Y、6Y、7Y和8Y的測序量＞50 000序列時，各OTU數基本穩定，表明測序量達到50 000時能夠反映8個樣品中真菌群落多樣性。

圖2 真菌稀釋性曲線圖

2.3 細菌和真菌的主坐標分析（PCoA）

PCoA是用較少的主坐標對分類單元進行有效地排序。Unifrac是比較不同微生物群落間結構差異的一種系統發育進化方法，用來計算序列在系統發育樹上的進化距離[9]。

由圖3和圖4可知，8份樣品在細菌豐富度和真菌豐富度上沒有出現重疊現象，均獨立，表明8份樣品細菌和真菌群落結構上有明顯的差異。

圖3 細菌基于加權Unifrac距離的PCoA圖

圖4 真菌基于加權Unifrac距離的PCoA圖

2.4 微生物群落結構分析

2.4.1 細菌群落結構分析

為挖掘樣品物種多樣性信息，對樣品的有效序列進行聚類，將相似性達到97%的序列聚類成為OTU再進行分析[10]。如表2所示，檢測到5個菌門，8個樣品優勢菌門是藍藻門和厚壁菌門。由圖5可知，測出10個菌屬，其中鏈球菌、魏斯氏菌和明串珠菌為優勢菌。

圖5 細菌累積圖（屬水平）

表2 在門水平上細菌相對含量表（單位：%）

2.4.2 真菌群落結構分析

基于18S rDNA測序門水平，檢測到5個菌門，具體數據見表3。在真菌水平上，優勢菌門為泡泡藻門和鏈球菌門。

表3 在門的水平上真菌相對含量表（單位：%）

由圖6可知，測出10個菌屬，優勢菌屬為蕓薹屬（Brassica）、辣椒屬（Capsicum）、蔥屬（Allium）和紫蘇屬（Perilla）。

圖6 真菌累積圖（屬水平）

3 結論

本文通過高通量宏基因測序技術對8種朝鮮族傳統發酵泡菜發酵初期微生物多樣性和豐富度進行分析。結果表明8種泡菜具有高度的細菌多樣性，且不同樣品間存在一定的共性和差異。在細菌水平上，優勢菌門為藍藻門和厚壁菌門；優勢菌屬為鏈球菌屬、魏斯氏菌屬和明串珠菌屬。在真菌水平上，優勢菌門為泡泡藻門和鏈球菌門；優勢菌屬為蕓薹屬、辣椒屬、蔥屬和紫蘇屬。