應(yīng)用高通量測序法分析延邊朝鮮族傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜發(fā)酵初期微生物多樣性

◎ 劉麗宅，劉笑笑，白 實(shí)，金永梅，魏春雁，李 剛

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長春 130033；2.敦化市動物疫病預(yù)防控制中心，吉林 敦化 133799）

泡菜是我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品，因其原輔料、發(fā)酵方式和區(qū)域的不同，泡菜中的核心菌群存在差異，從而影響其風(fēng)味和質(zhì)量[1]。研究泡菜中核心菌群具有重要的理論和實(shí)際意義[2-4]。延邊朝鮮族傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜以動、植物性產(chǎn)品為原料，與韓國泡菜區(qū)別在于輔料中不添加魚子醬和蝦醬，而添加當(dāng)?shù)靥禺a(chǎn)蘋果梨，該輔料的添加使朝鮮泡菜具有獨(dú)特的風(fēng)味、富含活性乳酸菌，并增加了其營養(yǎng)價(jià)值[5-6]。

本研究采用高通量測序技術(shù)對延邊朝鮮族傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜發(fā)酵初期微生物核心菌群進(jìn)行分析，探討微生物多樣性，不僅可以保護(hù)我國傳統(tǒng)泡菜優(yōu)良菌株資源，還可為傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

2020年6月4日采集延邊朝鮮族自治州8種發(fā)酵初期（第3 d）朝鮮族傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜（1Y：櫻菜；2Y：蘇子葉；3Y：辣白菜；4Y：蘿卜塊；5Y：桔梗；6Y：海虹；7Y：牛板筋；8Y：牛筋片），無菌操作，裝入50 mL離心管，密閉用冰袋運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑

Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒，Life；2×Taq Master Mix，Vazyme；MagicPure Size Selection DNA Beads，Transgen；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit，OMEGA。

1.3 儀器與設(shè)備

電泳儀電源、電泳槽，北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP；Qubit? 3.0熒光計(jì)，Invitrogen；臺式離心機(jī)，Thermo Fisher；PCR儀，BIO-RAD；漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 總DNA提取

采取液氮研磨，按試劑盒要求提取。

1.4.2 PCR擴(kuò)增

稀釋DNA作為模板，Illumina橋式PCR兼容引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)：引物341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）；805R（GACTACHV GGGTATCTAATCC）。真菌18 rDNA V4區(qū)擴(kuò)增區(qū)：引物18SV4F（GGCAAGTCTGGTGCCAG）；18SV4R（ACGGTATCTRATCRTCTTCG）。

PCR體 系：Bar-PCR Primer F 1 μL、2×Hieff?Robust PCR Master Mix 15 μL。PCR products 20 ng、Primer R 1 μL，用ddH20填充至30 μL。PCR條件：95 ℃，3 min；94 ℃，20 s；55 ℃，20 s；72 ℃，30 s；5次循環(huán)；72 ℃，5 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，根據(jù)其濃度等量混勻，用Qubit3.0 DNA試劑盒精確定量回收的DNA，量取10 ng，濃度為20 pmoL。

1.4.3 文庫構(gòu)建和測序

采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil Kit建庫試劑盒構(gòu)建文庫，Illumina MiSeq測序儀上機(jī)測序[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌和真菌的序列豐度及多樣性分析

采用Illumina MiSeq平臺對8種發(fā)酵泡菜中的微生物進(jìn)行高通量測序，獲得細(xì)菌和真菌序列。在閾值97%時(shí)，使用Chao1、Shannon、ACE和Simpson對單樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評估樣品中微生物群落的物種多樣性和豐富度。由表1可知，細(xì)菌有效序列591 061條，1 747個(gè)OTUs；真菌有效序列421 568條，443個(gè)OTUs，說明朝鮮族傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中細(xì)菌種類繁多、物種豐富。泡菜樣品6Y、7Y和8Y細(xì)菌的Shannon、ACE和Chao 1指數(shù)明顯高于其他5個(gè)樣品，說明樣品6Y、7Y和8Y的細(xì)菌物種豐度明顯高于其他5個(gè)樣品，且細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜。

表1 泡菜中細(xì)菌和真菌測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

2.2 稀釋曲線

稀疏曲線用來判斷測序數(shù)據(jù)量是否合理、測序深度是否可靠[8]。當(dāng)稀釋曲線趨于平坦，表明測序深度合理，且產(chǎn)生更多的OTU。

從圖1可看出，各樣品的稀釋曲線在小于103 074序列的條件下均沒有進(jìn)入平臺期，若繼續(xù)增加測序量，OTU數(shù)量也會隨著增加。4Y的測序量＞34 000序列時(shí)，1Y、2Y、3Y、5Y和6Y的測序量＞50 000序列時(shí)，7Y和8Y的測序量＞75 000序列時(shí)，基本滿足樣品中細(xì)菌群落多樣性。

圖1 細(xì)菌稀釋性曲線圖

從圖2可看出，當(dāng)測序量較低時(shí)，隨著測序量增加，每個(gè)樣品的OTU數(shù)上升，但OTU數(shù)上升逐漸緩慢。當(dāng)4Y的測序量＞21 800序列時(shí)，1Y、2Y、3Y、5Y、6Y、7Y和8Y的測序量＞50 000序列時(shí)，各OTU數(shù)基本穩(wěn)定，表明測序量達(dá)到50 000時(shí)能夠反映8個(gè)樣品中真菌群落多樣性。

圖2 真菌稀釋性曲線圖

2.3 細(xì)菌和真菌的主坐標(biāo)分析（PCoA）

PCoA是用較少的主坐標(biāo)對分類單元進(jìn)行有效地排序。Unifrac是比較不同微生物群落間結(jié)構(gòu)差異的一種系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化方法，用來計(jì)算序列在系統(tǒng)發(fā)育樹上的進(jìn)化距離[9]。

由圖3和圖4可知，8份樣品在細(xì)菌豐富度和真菌豐富度上沒有出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，均獨(dú)立，表明8份樣品細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)上有明顯的差異。

圖3 細(xì)菌基于加權(quán)Unifrac距離的PCoA圖

圖4 真菌基于加權(quán)Unifrac距離的PCoA圖

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

為挖掘樣品物種多樣性信息，對樣品的有效序列進(jìn)行聚類，將相似性達(dá)到97%的序列聚類成為OTU再進(jìn)行分析[10]。如表2所示，檢測到5個(gè)菌門，8個(gè)樣品優(yōu)勢菌門是藍(lán)藻門和厚壁菌門。由圖5可知，測出10個(gè)菌屬，其中鏈球菌、魏斯氏菌和明串珠菌為優(yōu)勢菌。

圖5 細(xì)菌累積圖（屬水平）

表2 在門水平上細(xì)菌相對含量表（單位：%）

2.4.2 真菌群落結(jié)構(gòu)分析

基于18S rDNA測序門水平，檢測到5個(gè)菌門，具體數(shù)據(jù)見表3。在真菌水平上，優(yōu)勢菌門為泡泡藻門和鏈球菌門。

表3 在門的水平上真菌相對含量表（單位：%）

由圖6可知，測出10個(gè)菌屬，優(yōu)勢菌屬為蕓薹屬（Brassica）、辣椒屬（Capsicum）、蔥屬（Allium）和紫蘇屬（Perilla）。

圖6 真菌累積圖（屬水平）

3 結(jié)論

本文通過高通量宏基因測序技術(shù)對8種朝鮮族傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜發(fā)酵初期微生物多樣性和豐富度進(jìn)行分析。結(jié)果表明8種泡菜具有高度的細(xì)菌多樣性，且不同樣品間存在一定的共性和差異。在細(xì)菌水平上，優(yōu)勢菌門為藍(lán)藻門和厚壁菌門；優(yōu)勢菌屬為鏈球菌屬、魏斯氏菌屬和明串珠菌屬。在真菌水平上，優(yōu)勢菌門為泡泡藻門和鏈球菌門；優(yōu)勢菌屬為蕓薹屬、辣椒屬、蔥屬和紫蘇屬。