谷物及其制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其衍生物的檢測及污染規律研究

◎ 王 瑜，郭愛娟

（1.青島市產品質量檢驗研究院，山東 青島 266000；2.歐陸分析檢測技術服務（青島）有限公司,山東 青島 266000）

谷物在生產、加工、儲藏及運輸過程中，可能因處理不當而出現霉變，導致感染真菌毒素。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）又稱嘔吐毒素，廣泛存在與霉變糧食中，DON及其衍生物能夠引發發燒、嘔吐、腹瀉的癥狀，嚴重時甚至會對人們的生命安全造成威脅[1-2]。本文通過HLB固相萃取柱來凈化樣品，建立谷物以及制品中DON及其衍生物的高效液相測定法，以提高我國的食品安全水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷物樣品（大米26份、玉米糝20份、掛面24份和小麥粉26份），市售。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-3-葡萄糖苷（D3G），50 μg·mL-1；15- 乙 酰 基 脫 氧 雪 腐 鐮 刀 菌 烯 醇（15ADON）、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3ADON）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）標準溶液，100 μg·mL-1；實驗室自制超純水，正己烷、乙酸銨、甲醇和乙腈為色譜純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

流速為0.3 mL·min-1，流動相A為乙腈，B為2 mmol·L-1乙酸銨溶液，流動相體積比為A∶B=35∶65；Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫為 35 ℃，進樣量為 5 μL。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子源，正負離子同時進行掃描，多反應監測。離子源溫度為600 ℃，電噴霧電壓為4 500～5 500 V，碰撞室出入口的電壓均為10 V，輔助氣、霧化氣及氣簾氣的壓力分別為344.75 kPa、379.23 kPa和310.28 kPa，碰撞氣壓力中等，掃描時間為3.5～8.5 min。

1.2.3 樣品處理

（1）處理1。取樣2.5 g，加10.0 mL水，超聲提取 20 min，5 000 r·min-1離心 10 min， 過 0.22 μm 膜待測。

（2）處理2。取樣2.0 g，加20.0 mL的75%乙腈水溶液，超聲提取20 min，5 000 r·min-1離心10 min，取5.0 mL上清液過HLB柱，取過柱液5.0 mL氮氣吹干，定容至1.0 mL，過0.22 μm膜后待測。

（3）處理3。在50 mL離心管中放置2 g的試樣，加入20 mL的75%乙腈水溶液，5 000 r·min-1離心10 min，超聲20 min，收集上清液。在50 mL離心管中加入5 mL的上清液，并加入乙腈飽和的正己烷溶液 10 mL，混合 2 min，5 000 r·min-1離心 5 min；去除正己烷層，50 ℃氮氣吹干，使用5 mL水溶解殘渣并等待凈化。使用HLB固相萃取柱，甲醇和水各3 mL活化平衡。（2）中制備的溶液上柱，流速為每秒1～2滴。分別采用5%甲醇水溶液1 mL與水3 mL對柱子進行淋洗，抽干后用5 mL甲醇洗脫，50 ℃氮氣吹干。加入1 mL流動相溶液，混勻，過0.22 μm濾膜后等待進樣。

2 結果與分析

2.1 優化色譜和質譜條件

對4種真菌毒素在不同的電離模式下的響應情況進行研究，3ADON與15ADON是同分異構體，其在[M-H]-與[M+H]+模式下響應都比較高，但[M+H]+模式有著比較大的離子對干擾，因此使用[M-H]-模式進行監測。D3G在[M-H]-與[M+H]+模式下響應都比較低，在[M+NH4]+模式有著比較高的響應，所以采用[M+NH4]+模式檢測。DON采用[M-H]-監測，其基線干擾會比較少，有較高的響應。在這4種真菌中，D3G脫去葡萄糖苷基團后會變為DON，優化洗脫梯度與色譜柱，能夠得到較好的分離度。

實驗結果表明，采取T3色譜柱按照本實驗方法洗脫時，能夠有效分離這4種化合物，如圖1所示。

圖1 4種毒素的總離子流圖

2.2 優化樣品前處理方法

由表1可知，前處理方式3的上機液比較干凈，并且4種毒素的回收率和重復性較好，本文采取前處理3的方式進行后續實驗。

表1 不同前處理方式的回收率表

2.3 4種毒素的回收率和線性關系

如表2所示，配制標準溶液根據上述的方法和儀器條件測定，最終得出4種毒素在5.0～250.0 μg·kg-1范圍內有良好線性關系，相關系數R2均大于0.99，檢出限均為 10 μg·kg-1，定量限為 20 μg·kg-1。

表2 4種毒素的線性方程與相關系數表

如表3所示，4種毒素在不同樣品中的加標回收率結果表明：方法的平均回收率為89.6%～118.1%，RSD為1.6%～8.7%。

表3 4種毒素在不同樣品中的加標回收率表

2.4 樣品污染情況

對4種毒素在不同樣品中的含量進行檢測，結果表明，只有小麥粉檢出3ADON，所有樣品均未檢出15ADON；DON的含量和檢出率比D3G高，含量最高的是掛面。樣品檢出DON時其他3種毒素不一定檢出，而檢出其他3種毒素時一定會檢出DON，即DON的檢出率能夠代表樣品中毒素的檢出率。在所有樣品中，毒素檢出率依次為DON＞D3G＞3ADON＞15ADON。由表4可知，4類谷物中，DON毒素檢出率最高的是掛面，達到了84.4%，其次是小麥粉，因此可以看出，掛面的污染最為嚴重。

表4 谷物制品中DON和D3G的含量表

3 結論

當前，雖然沒有直接證據證明隱蔽型真菌毒素的毒性強于原型的真菌毒性，但有研究數據表明，一些隱蔽型真菌毒素在代謝過程中可能會被水解，并釋放出毒素原型[3-4]。因此，隱蔽型真菌毒素是危害消費者健康的潛在風險之一[5]。

本研究的數據印證了這種風險的存在，DON與其隱蔽型D3G在谷物中的污染不容忽視。本文建立的檢測方法，可以滿足谷物及谷物制品中DON及其衍生物的檢測要求，對保證我國食品安全具有重要意義。