包裝飲用水中銅綠假單胞菌生長(zhǎng)曲線及其快速檢測(cè)

◎ 覃 宇，向麗萍，吳金春，王 奧，任道援，張祖文

（遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州 遵義 563000）

銅綠假單胞菌作為一種對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求極低的致病菌，其繁殖能力極強(qiáng)，具有很強(qiáng)的耐藥性，廣泛存在于日常生活中，屬于條件致病菌，會(huì)引發(fā)一系列疾病[1]。因此，對(duì)于該菌的科學(xué)研究及其重要。國(guó)內(nèi)外對(duì)于該菌的研究主要有耐藥性研究、致病因子研究、遺傳物質(zhì)研究等，而對(duì)于該菌的基礎(chǔ)性研究比較少。本次研究是從包裝飲用水這一日常生活中的必需品著手，研究銅綠假單胞菌在其中的生長(zhǎng)情況及探討一種快速確定其濃度的方法[2]，得到吸光度值與菌落數(shù)成反比[3]。使用此法可快速確定菌懸液中銅綠假單胞菌菌落數(shù)，對(duì)于后續(xù)開(kāi)展相關(guān)試驗(yàn)可明顯縮短試驗(yàn)時(shí)間，加快試驗(yàn)進(jìn)程，也填補(bǔ)了銅綠假單胞菌基礎(chǔ)性研究的空白。

1 材料與方法

1.1 菌株及主要耗材

銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)seudomonas aeruginosa（ATCC 9027)、假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基/CN瓊脂、金氏B培養(yǎng)基、乙酰胺液體培養(yǎng)基、綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、氧化酶試劑、鈉氏試劑和一次性接種環(huán)均購(gòu)于廣州陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。試驗(yàn)所用培養(yǎng)基需121 ℃滅菌15 min后使用；革蘭氏陰性鑒定卡（GN卡）采購(gòu)于梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.2 主要設(shè)備

VITEK?2 compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)（梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司）、生物安全柜（蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司）、隔水式培養(yǎng)箱（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、全自動(dòng)立式壓力滅菌器（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）和紫外分光光度計(jì)（北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 繪制銅綠假單胞菌生長(zhǎng)曲線

用一次性接種環(huán)挑取一環(huán)實(shí)驗(yàn)室保存銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（編號(hào)ATCC 9027）污染自超市采購(gòu)的經(jīng)檢測(cè)無(wú)菌落生長(zhǎng)的5 L裝包裝飲用水（同一批次購(gòu)買2瓶），在20 ℃下放置30 d，且在放置過(guò)程中，在其生長(zhǎng)曲線的穩(wěn)定期，吸取1 mL加入至另一瓶包裝飲用水中，在4 ℃下放置35 d（在污染之前，每桶水分別取500 mL在各個(gè)溫度下放置，留作空白對(duì)照），根據(jù)其在水中的銅綠假單胞菌的菌落數(shù)變化繪制生長(zhǎng)曲線。

（1）標(biāo)準(zhǔn)菌株活化。將保存于-70 ℃超低溫冰箱的銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株磁珠管取出放入4 ℃冰箱，讓其磁珠溫度升高。提前制備營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，在超凈工作臺(tái)下完成以下步驟：用接種針挑取磁珠，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上劃線，36 ℃下培養(yǎng)24 h。待營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)出銅綠假單胞菌單菌落后，開(kāi)始下一步驟。

（2）操作步驟及培養(yǎng)。不同溫度下保的試驗(yàn)樣品，每間隔一段時(shí)間，從中吸取1 mL加入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，倒入已滅菌的假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基/CN瓊脂，然后在36 ℃下培養(yǎng)48 h，然后計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 分光光度計(jì)法快速測(cè)定銅綠假單胞菌菌懸液濃度

（1）標(biāo)準(zhǔn)菌株活化，與1.3.1步驟相同。

（2）制備菌懸液。將上一步驟生長(zhǎng)的銅綠假單胞菌單菌落加入裝有3 mL濃度0.45%的無(wú)菌生理鹽水中，用濁度儀調(diào)整其麥?zhǔn)蠞岫葹? MCF（其中細(xì)菌濃度約為3×108CFU·mL-1），備用。

（3）測(cè)定吸光度值。取1 mL制備的麥?zhǔn)蠞岫葹? MFC的菌懸液（其濃度約為3×108CFU·mL-1）加入到4 mL無(wú)菌生理鹽水中，此時(shí)菌懸液被稀釋5倍，其菌懸液濃度約為 0.6×108CFU·mL-1；將 0.6×108CFU·mL-1菌懸液取1 mL加入到9 mL生理鹽水中，此時(shí)菌懸液被稀釋10倍，菌懸液濃度約為0.6×107CFU·mL-1；以同樣的方式，依次做梯度稀釋，稀釋度至菌懸液濃度約為0.5×102CFU·mL-1；用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定不同稀釋度的吸光度值[4]。

（4）測(cè)定菌落數(shù)。在超凈工作臺(tái)上用1 mL移液管吸取上一步驟中不同稀釋度的菌懸液至無(wú)菌平皿中，每個(gè)稀釋度做雙平行。同時(shí)做生理鹽水空白和培養(yǎng)基空白。適時(shí)導(dǎo)入合適溫度的平板計(jì)數(shù)瓊脂，待瓊脂凝固后倒置培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)箱中36 ℃，培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)每個(gè)稀釋度菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠假單胞菌生長(zhǎng)曲線結(jié)果與分析

2.1.1 結(jié)果

20 ℃下銅綠假單胞菌生長(zhǎng)曲線圖如圖1所示。由圖1可知，銅綠假單胞菌生長(zhǎng)穩(wěn)定期在第4～6 d。在其菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，吸取1 mL加入包裝飲用水中，4 ℃下放置35 d，其試驗(yàn)樣品結(jié)果生長(zhǎng)曲線如圖2所示。

圖1 20 ℃銅綠假單胞菌生長(zhǎng)曲線圖

圖2 4 ℃放置35 d銅綠假單胞菌生長(zhǎng)曲線圖

2.1.2 分析

由試驗(yàn)結(jié)果可知，銅綠假單胞菌對(duì)于生長(zhǎng)環(huán)境要求不高，但其對(duì)溫度特別敏感。在20 ℃下，其生長(zhǎng)曲線包含細(xì)菌的4個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期：遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。其穩(wěn)定期為放置的第4～6 d，此期間其菌落數(shù)無(wú)變化，無(wú)其他干預(yù)手段，整個(gè)生長(zhǎng)周期在30 d左右。但在4 ℃下，該菌基本不生長(zhǎng)，菌落數(shù)一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這也可以解釋在冬天溫度較低時(shí)，部分包裝飲用水企業(yè)銅綠假單胞菌檢出率不高的現(xiàn)象。

2.2 吸光度值與銅綠假單胞菌關(guān)系的結(jié)果與分析

2.2.1 結(jié)果

不同菌懸液濃度銅綠假單胞菌菌落數(shù)結(jié)果與對(duì)應(yīng)的吸光度值見(jiàn)表1。由表1可知，當(dāng)稀釋度較高時(shí)吸光度值趨近于0。當(dāng)銅綠假單胞菌菌落數(shù)在2.95×105CFU·mL-1，吸光度值為0.004，之后其吸光度值才開(kāi)始呈現(xiàn)規(guī)律性變化。

表1 銅綠假單胞菌菌落數(shù)及吸光度值表

以銅綠假單胞菌菌落數(shù)為2.95×105CFU·mL-1、2.75×106CFU·mL-1、8.75×106CFU·mL-1、2.95×107CFU·mL-1和 4.75×107CFU·mL-1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖3。以菌落數(shù)為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，其相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.997 8。

2.2.2 分析

由試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)銅綠假單胞菌菌落數(shù)在2.95×105CFU·mL-1及以上時(shí)，其吸光度值變化明顯，可以用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其菌懸液中菌落數(shù)；而低于此菌落數(shù)時(shí)，其吸光度值變化不明顯，當(dāng)吸光度值趨近于零時(shí)不適用于紫外分光光度計(jì)法。因此，當(dāng)銅綠假單胞菌落數(shù)需要快速得出時(shí)，且菌落數(shù)大于2.95×105CFU·mL-1或吸光度值在0.04及以上時(shí)，可以用紫外分光光度計(jì)法快速測(cè)出其菌懸液中菌落數(shù)，此時(shí)吸光度值與銅綠假單胞菌菌落數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)，其R2=0.997 8。

圖3 銅綠假單胞菌菌落數(shù)與吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3 結(jié)論與討論

通過(guò)繪制銅綠假單胞菌在包裝飲用水中的生長(zhǎng)曲線可知：銅綠假單胞菌極易存活，當(dāng)水廠被污染后難以徹底殺滅。若無(wú)其他干預(yù)手段，其生長(zhǎng)周期在30 d左右。銅綠假單胞菌對(duì)生長(zhǎng)溫度極其敏感，可考慮從溫度入手，再配合適宜消毒劑，殺滅該菌。繪制銅綠假單胞菌生長(zhǎng)曲線，認(rèn)識(shí)其在包裝飲用水中生長(zhǎng)規(guī)律將會(huì)幫助繼續(xù)開(kāi)展相關(guān)研究，也可以讓飲用水廠更直觀的了解該菌的生長(zhǎng)情況。

通過(guò)用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定銅綠假單胞菌菌懸液中菌落數(shù)和吸光值度值之間的關(guān)系可知，當(dāng)菌懸液濃度較低或測(cè)出其吸光度值較低時(shí)，不適用于紫外分光光度計(jì)法。麥?zhǔn)媳葷岱A(yù)測(cè)濁度為1.0 MFC時(shí)，銅綠假單胞菌菌落數(shù)為3.45×108CFU·mL-1，與預(yù)估的菌落數(shù)值存在差距，其繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2=0.997 8，說(shuō)明不同細(xì)菌種類大小和形態(tài)都有區(qū)別。

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水》（GB 19298—2014）產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定包裝飲用水不得檢出銅綠假單胞菌[5]。現(xiàn)階段對(duì)于該菌的殺滅方式主要是以消毒劑的方式對(duì)水廠區(qū)域及成品水進(jìn)行消毒，通過(guò)上述該菌的生長(zhǎng)曲線及與吸光度值關(guān)系兩個(gè)方面的研究，當(dāng)水廠區(qū)域環(huán)境及生產(chǎn)環(huán)節(jié)溫度較低時(shí)，使用消毒劑消毒，可以達(dá)到更好的殺滅效果。而通過(guò)吸光度值與銅綠假單胞菌菌落數(shù)的關(guān)系，可以快速確定包裝飲用水中該菌的菌落數(shù)含量。