高效液相色譜-串聯質譜法檢測豬肝中硝基咪唑類藥物殘留量

◎ 富 玥

（巴彥淖爾市產品質量計量檢測中心，內蒙古 巴彥淖爾 015000）

硝基咪唑類藥物是一類具有硝基咪唑環結構的化合物。常見的硝基咪唑類藥物有甲硝唑、甲硝唑代謝物、地美硝唑、二甲硝基咪唑-代謝物、洛硝噠唑、異丙硝唑、苯硝咪唑、氯甲硝咪唑和4-硝基咪唑，由于該類藥物具有細胞誘變性、對哺乳動物致癌、致畸和遺傳毒性[1]，因此歐盟和我國將硝基咪唑列入食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單[2]。

目前硝基咪唑類藥物的檢測方法主要有液相色譜法、液相色譜-質譜法和氣相色譜法等[3]。但是豬肝中過高的基質干擾會嚴重影響檢測痕量樣品定性和定量的準確性。本文根據硝基咪唑類藥物的性質采用甲醇提取，用C18固相萃取柱代替傳統凝膠色譜，優化了國家標準方法，進一步簡化樣品前處理步驟，優化流動相體系，達到最好的分離和質譜響應效果[4-5]。以液相色譜-串聯質譜作為定性、定量手段，建立了一種回收率高、快捷、靈敏、穩定的檢測方法，為豬肝中硝基咪唑類藥物檢測提供參考方法和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇HPLC級、甲酸HPLC級均購于科密歐；水為去離子水，由PCJ-40純水機制得。C18固相萃取柱，500 mg/6 mL；硝基咪唑類標準品，甲硝唑（Metronidazole，MNZ）、甲硝唑代謝物（2-hydroxymethyl-5-nitro-im-idazole-1-ethano，MNZOH）、地美硝唑（Dimetridazole，DMZ）、二甲硝基咪唑-代謝物（1-Methyl-5-nitro-1H-imidazole-2-methanol，HMMNI）、洛硝噠唑（Ronidazole，RNZ）、異丙硝唑（Ipronidazole，IPZ），均購于天津阿爾塔，純度不小于98%。

1.2 儀器設備

Wters Xevo TQ-S/UPLC I-Class超高效液相色譜-質譜聯用儀；HC-3018R高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；XW-80A旋渦振蕩器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；OA-SYS氮吹儀（美國）；PCJ-40純水機（成都品成科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

分別準確吸取各類標準品，用甲醇稀釋成1.0 μg·mL-1的標準混合使用液，冷凍避光保存（低于-18 ℃），使用時吸取適當體積標準混合使用液用甲醇稀釋成合適的標準工作液，臨用現配。

1.3.2 樣品提取

取豬肝樣品20 （g精確至0.1 g），置于50 mL離心管中，加入甲醇20 mL，旋渦混勻2 min，8 000 r·min-1離心10 min（溫度低于10 ℃），取上清液于另一離心管內，重復提取1次，合并上清液，氮氣吹至2 mL左右，加入3 mL甲醇，旋渦混勻，待凈化。

1.3.3 凈化

用C18固相萃取柱，用5 mL甲醇活化，將5 mL提取液過柱，收集流出液，再用10 mL甲醇進行洗脫，氮氣吹至近1 mL（溫度低于30 ℃），用甲醇補至1 mL，過0.22 μm濾膜后待測。

1.3.4 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm× 2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A為0.1%甲 酸 水，B為 甲 醇；0～ 1 min，90%A，curve6；1～ 3 min，90% ～ 0%A，curve6；3.0～ 4.3 min，0%A，curve6；4.3～5.0 min，0%～90%A，curve1。流速 0.2 mL·min-1，柱溫 30 ℃，進樣量 10 μL。

（2）質譜條件。電噴霧離子源正離子模式（ESI+）；檢測模式：多反應監測（MRM）；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流速650 L·h-1；錐孔氣流150 L·h-1；碰撞氣為氬氣。

經優化后各化合物的檢測離子對（m/z）、錐孔電壓等質譜參數見表1。

表1 質譜參數表

2 結果與分析

2.1 色譜柱及流動相的選擇

試驗比對了Inertsil C8-3色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）和ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm× 2.1 mm，1.7 μm）色譜柱對目標分析物的分離效果。結果發現，C8-3柱中的粒徑較大，對物質保留較差，導致過早出峰以及分離度太小，影響出峰。采用C18柱可有效分離且在合適的時間段出峰。

流動相比對了甲醇和乙腈作為流動相時各待測物的色譜圖。在乙腈做流動相時，待測物的峰變寬，拖尾較嚴重，用甲醇做流動相時，待測物峰無拖尾，峰形較好，本試驗最終選擇甲醇為流動相。

2.2 標準曲線與檢出限

配置甲硝唑類標準溶液濃度為 0 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1和 500 μg·L-1混合基質標準工作液，以定量離子峰面積為縱坐標（Y），以對應濃度為橫坐標（X）進行線性回歸分析，得到線性回歸方程。空白樣品中加入低濃度標準對照溶液，以信噪比（S/N=3）計算待測物的檢出限，結果見表2。由表2可得，各組分線性方程回歸系數均在0.993以上，各組分線性關系良好。

表2 甲硝唑類藥物線性范圍、回歸方程、相關系數及檢出限表

2.3 精密度與回收率

在空白樣品中添加甲硝唑類藥物標準工作液，使其含量分別為 1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1、4.0 μg·kg-1，每個濃度6份平行試驗，并計算相對標準偏差。從表3中可以看出，甲硝唑類藥物均有較好的回收率，平均回收率為78.7%～95.6%，實測值相對標準偏差為0.56%～6.25%，符合《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）附錄F檢測方法確認的技術要求以及F.1關于精密度范圍和回收率范圍的要求。代表圖譜及空白樣品質量色譜圖見圖1。

圖1 6種甲硝唑類藥物定性、定量離子標準色譜圖

表3 甲硝唑類藥物的平均回收率、相對標準偏差表

3 結論

本文使用液相色譜-串聯質譜法同時檢測豬肝中甲硝唑、甲硝唑代謝物、地美硝唑、二甲硝基咪唑-代謝物、洛硝噠唑和異丙硝唑類藥物殘留量，同時，建立了一種簡便、快速、高效的分析豬肝中甲硝唑類藥物的方法，與目前國家標準方法相比，該方法優化了前處理過程、適用范圍廣泛，能同時準確定量及定性，且結果準確、重現性好，可滿足日常樣品檢驗要求。