以凝固型發(fā)酵乳為樣本探究pH對(duì)大腸菌群的影響

◎ 李玉平，李 鵬，孫叢叢，凌 森

（河北三元食品有限公司，河北 石家莊 050700）

溶液的pH值等于溶液中氫離子濃度的負(fù)對(duì)數(shù)，代表了溶液的酸堿度。pH值是影響微生物生長(zhǎng)的一個(gè)關(guān)鍵因素，微生物會(huì)因細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變性和核酸的變異出現(xiàn)生物活性下降的現(xiàn)象；當(dāng)pH有所改變時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)因受到影響而發(fā)生改變，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的有效利用率降低，微生物的生長(zhǎng)速度隨之下降[1]。不同微生物適宜生存的pH環(huán)境不同，在溫度、水分等條件適宜的情況下，菌體內(nèi)酶的活性在最適pH或最適pH區(qū)間時(shí)最高，生長(zhǎng)速度也最快，環(huán)境的pH發(fā)生變化會(huì)在一定程度上影響微生物的生長(zhǎng)速度，在一定pH區(qū)間外微生物會(huì)受到損傷而死亡[1]。

大腸菌群（Coliforms）一般指一群在特定培養(yǎng)條件下能夠發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌[2]。該菌群與人們的生活息息相關(guān)，常出現(xiàn)在糞便和被糞便污染的地帶。大腸菌群計(jì)數(shù)是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生狀況的重要指標(biāo)之一，在食品衛(wèi)生方面中得到廣泛使用[3]。大腸菌群含量的高低不僅可以反映食品被糞便污染的程度，還可以直接影響食品的儲(chǔ)存期、口感和人體健康。大腸菌群是條件性致病菌，其較強(qiáng)的產(chǎn)毒能力決定了其具有較低的感染劑量，感染大腸菌群后的中毒反應(yīng)有發(fā)熱、嘔吐、腹瀉和腹痛等。一直以來(lái)人們都在不斷關(guān)注著影響大腸菌群檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的因素及注意事項(xiàng)，持續(xù)探究著大腸菌群的生存特點(diǎn)。為了得到更加準(zhǔn)確的大腸菌群計(jì)數(shù)結(jié)果，首先要熟練掌握國(guó)家檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，從方法的適用性、培養(yǎng)基及試劑的滅菌要求、使用溫度和使用量、操作步驟（樣品稀釋、接種時(shí)間、培養(yǎng)溫度和時(shí)間）、平板計(jì)數(shù)和證實(shí)試驗(yàn)到結(jié)果報(bào)告等每個(gè)環(huán)節(jié)都要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行。在研究大腸桿菌的生存特點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在不同的極端環(huán)境下，大腸桿菌會(huì)產(chǎn)生不同的應(yīng)激機(jī)制，有針對(duì)性地對(duì)抗高壓、低溫、高熱和高酸等壓力帶來(lái)的威脅。近幾年有不少學(xué)者對(duì)大腸桿菌的耐酸性進(jìn)行了研究，不同的酸性條件下大腸桿菌的生長(zhǎng)情況也不盡相同。

李小媚等[4]研究表明，pH值為5.0～7.0時(shí)，大腸桿菌（0157:H7）可以良好地生長(zhǎng)；pH值為2.0～4.0時(shí)，大腸桿菌（0157:H7）的生長(zhǎng)受到了抑制；當(dāng)pH值＜2.0時(shí)，大腸桿菌（0157:H7）幾乎被全部殺死。另外，當(dāng)環(huán)境中的pH值不同時(shí)，大腸桿菌（0157:H7）所呈現(xiàn)出來(lái)的形態(tài)也有所不同，當(dāng)環(huán)境的pH值降低時(shí)細(xì)胞由長(zhǎng)桿狀變成短桿狀或橢圓狀，由此可見大腸桿菌（0157:H7）對(duì)酸的耐受性較強(qiáng)，可以很好地對(duì)抗酸性環(huán)境對(duì)其生長(zhǎng)的影響。這一特性使得酸性果汁、乳制品等酸性或發(fā)酵食品極易被大腸桿菌污染，同時(shí)也反映出了在對(duì)食品進(jìn)行大腸菌群計(jì)數(shù)檢驗(yàn)過程中，pH是影響檢測(cè)結(jié)果的重要因素之一[5]。為探究不同pH值對(duì)大腸菌群生長(zhǎng)的影響，本試驗(yàn)以凝固型發(fā)酵乳為樣本，采用平板計(jì)數(shù)的方法，分別對(duì)存放前后的已接種等量大腸埃希氏菌的不同pH值的樣本稀釋液進(jìn)行大腸菌群計(jì)數(shù)。通過比較存放前后大腸菌群含量的變化來(lái)判定pH對(duì)大腸菌群生長(zhǎng)的影響[6]。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

滅菌吸管、直徑為90 mm的無(wú)菌平皿、無(wú)菌錐形瓶、試管和水浴鍋，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；（36±1）℃電熱恒溫培養(yǎng)箱，DNP-9272BS-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；pH計(jì)，DELTA320，梅特勒托利多有限公司；電子天平，T1000，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；高壓滅菌器，YXQ-100A，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試劑

0.85%無(wú)菌生理鹽水、1 mol·L-1NaOH 溶液、1 mol·L-1HCl溶液，均為自制。

1.3 培養(yǎng)基

本次試驗(yàn)使用的培養(yǎng)基均按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB 4789.28—2013）的要求進(jìn)行質(zhì)量驗(yàn)收，且驗(yàn)收合格的商品化脫水合成培養(yǎng)基。

結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）：嚴(yán)格按照培養(yǎng)基標(biāo)簽上的方法進(jìn)行配制，臨用前制備。

煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯：嚴(yán)格按照培養(yǎng)基標(biāo)簽上的方法進(jìn)行配制，分裝至放有倒置玻璃小導(dǎo)管的試管中，每管10 mL，121℃條件下高壓滅菌15 min。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌懸液

本次試驗(yàn)使用的是從美國(guó)典型菌株保藏中心購(gòu)入的大腸埃希氏菌，菌懸液由儲(chǔ)備菌株在BHI（非選擇性肉湯）中培養(yǎng)過夜后制得[7]。

1.4.2 樣品稀釋

無(wú)菌條件下，準(zhǔn)確稱量50 g樣本于裝有50 mL無(wú)菌生理鹽水的容器中，充分混勻，共制備6份，對(duì)稀釋液分別編號(hào)為S0、S1、S2、S3、S4和S5，用1 mol·L-1NaOH 溶液和 1 mol·L-1HCl溶液調(diào)節(jié)各稀釋液的pH值，測(cè)得各稀釋液的pH值依次為4.4（未調(diào)pH）、2.0、3.0、4.4（未調(diào)pH）、5.3和6.8。

1.4.3 大腸菌群計(jì)數(shù)

（1）對(duì)S0（未接種）進(jìn)行大腸菌群計(jì)數(shù)測(cè)試。用無(wú)菌吸管吸取S0稀釋液于2個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每皿2 mL，此接種量相當(dāng)于1 mL樣本原液，記為100；同樣量取2 mL S0稀釋液至裝有8 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，振蕩均勻，用無(wú)菌吸管量取上述勻液至2個(gè)無(wú)菌平皿，每皿1 mL，此接種量相當(dāng)于0.1 mL樣本原液，記為10-1。另取1 mL無(wú)菌生理鹽水至無(wú)菌培養(yǎng)皿中，作為空白對(duì)照。

（2）對(duì)S1～S5（接種）進(jìn)行大腸菌群計(jì)數(shù)測(cè)試。向稀釋液S1、S2、S3、S4和S5中分別加入ATCC 25922大腸埃希氏菌的工作菌懸液1 mL，振蕩均勻，用無(wú)菌吸管吸取各個(gè)已接種的稀釋液，分別接種至2個(gè)無(wú)菌平皿，每皿2 mL，記為100；量取2 mL各稀釋液于盛有8 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，充分混勻，記為10-1；用無(wú)菌吸管量取10-1勻液1 mL于盛有9 mL生理鹽水的試管中（吸管尖端不要觸及稀釋液面），充分混勻，制成10-2的樣品勻液。按前面的操作，制成10倍遞增系列稀釋液。每個(gè)稀釋度，換用1支無(wú)菌吸管。取多個(gè)連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無(wú)菌平皿，每皿1 mL。

（3）向所有平皿中倒入46 ℃左右的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂，每皿需倒15～20 mL。順時(shí)針搖晃平皿，使培養(yǎng)基和接種的樣液混合充分，放置一段時(shí)間，至瓊脂完全凝固后，倒入3～4 mL VRBA覆蓋整個(gè)平板。完全凝固后，將平皿倒置，在（36±1）℃條件下培養(yǎng)18～24 h。

（4）接種完成后，將稀釋液S1～S5放置6.5 ℃環(huán)境中存放1 d，重復(fù)上述操作。

（5）培養(yǎng)結(jié)束后，嚴(yán)格按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》（GB 4789.3—2016）9.3的規(guī)定，計(jì)數(shù)典型和可疑菌落數(shù)。典型菌落是紫紅色，有紅色的膽鹽沉淀環(huán)在其周圍。嚴(yán)格按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》（GB 4789.3—2016）9.4證實(shí)試驗(yàn)的規(guī)定，從VRBA平板上取10個(gè)典型單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)種于BGLB肉湯試管內(nèi)，于（36±1）℃條件下培養(yǎng)24～48 h，結(jié)果BGLB肉湯管均有氣體產(chǎn)生。

2 結(jié)果與分析

試樣S0（未接種）的計(jì)數(shù)結(jié)果為＜1 CFU·g-1，說(shuō)明樣本沒有被大腸菌群污染；分別對(duì)S1～S55個(gè)試樣的各稀釋度平板進(jìn)行大腸菌群計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，試樣的pH值為4.4～6.8時(shí)，存放前后大腸菌群數(shù)量沒有明顯變化，數(shù)量級(jí)不變，由此可見，大腸菌群有較強(qiáng)的耐酸性；試樣的pH值=3時(shí)，存放前后大腸菌群含量由7.8×106CFU·g-1減少至1.3×104CFU·g-1，pH值的降低明顯影響了大腸菌群的生物活性；試樣的pH值＜3時(shí)，存放后大腸菌群幾乎全部死亡，含量由7.5×106CFU·g-1減少至0，大腸菌群在酸性較高的環(huán)境下受到嚴(yán)重?fù)p傷而死亡。綜上，本次試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)大腸菌群含量較大時(shí)，不同的pH值對(duì)大腸菌群有不同程度的影響，pH值在4.4～6.8時(shí)對(duì)大腸菌群沒有明顯抑制性；pH值≤3時(shí)對(duì)大腸菌群有顯著抑制性。

圖1 試樣S1～S5存放前后大腸菌群含量變化趨勢(shì)圖

3 結(jié)論

大腸菌群對(duì)酸有較強(qiáng)的耐受性，在pH值≤3的條件下受到顯著抑制。大腸菌群計(jì)數(shù)是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生污染狀況的重要指標(biāo)，為了準(zhǔn)確得到食品中大腸菌群的含量，檢測(cè)過程應(yīng)注意培養(yǎng)基以及樣品勻液的pH值，調(diào)節(jié)pH值至國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的范圍。另外，產(chǎn)品在存放過程中pH值的變化也會(huì)對(duì)大腸菌群的含量有影響，因此要注意檢測(cè)的及時(shí)性。