枯草芽孢桿菌產(chǎn)腺苷補料發(fā)酵工藝的研究

◎ 陳華強

（廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司，廣東 肇慶 526040)

腺苷（Adenosine）是一種核苷類物質(zhì)，存在于不同類型的細(xì)胞中，是冬蟲夏草、靈芝及人參等名貴藥材的主要活性成分，在人體的核苷代謝和生理生化方面起著重要作用，在食品、保健品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[1-2]。國內(nèi)對腺苷的研究主要集中于菌株誘變篩選、發(fā)酵動力學(xué)研究、培養(yǎng)基優(yōu)化等[3-5]。梅漫莉等[6]研究了黃嘌呤和谷氨酰胺對產(chǎn)腺苷的影響，通過底物添加、流加補料的發(fā)酵方式加入黃嘌呤、谷氨酰胺，有效地提高了腺苷的產(chǎn)量。根據(jù)核苷酸代謝的補救途徑，腺苷合成的前體物質(zhì)為次黃嘌呤，因此在發(fā)酵過程中添加適量的前體物質(zhì)次黃嘌呤可以增加腺苷的產(chǎn)率[7]。陳華強[8]研究了檸檬酸鈉與HMP代謝途徑中碳流量的關(guān)系以及次黃嘌呤對發(fā)酵產(chǎn)苷和發(fā)酵過程的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)次黃嘌呤可以使腺苷發(fā)酵產(chǎn)量增加。本研究擬考察發(fā)酵液中次黃嘌呤前體物質(zhì)的質(zhì)量濃度與發(fā)酵產(chǎn)率的關(guān)系、次黃嘌呤前體物質(zhì)加入方式與腺苷產(chǎn)量的關(guān)系，通過搖瓶、50 L發(fā)酵罐、10 m3發(fā)酵中試罐，整合補料與溶解氧的發(fā)酵過程調(diào)控，逐級放大試驗，以期為工業(yè)化應(yīng)用研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵菌種

發(fā)酵菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，組氨酸和黃嘌呤缺陷）AR090，由廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司分離和保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

酵母膏 5.0 g·L-1，牛肉膏 10 g·L-1，氯化鈉 2.5 g·L-1，瓊脂 25 g·L-1，蛋白胨 4.0 g·L-1，pH 值為 7.0 ～ 7.2，滅菌壓力0.1 MPa，滅菌時間20 min[8]。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

酵母膏 20 g·L-1，葡萄糖 20 g·L-1，硫酸銨 5 g·L-1，七水硫酸亞鐵0.01 g·L-1，磷酸二氫鉀3 g·L-1，七水硫酸鎂 0.3 g·L-1，七水硫酸錳 0.01 g·L-1，黃嘌呤 0.03 g·L-1，組氨酸0.03 g·L-1，pH值為7.0～7.2，滅菌壓力0.1 MPa，滅菌時間20 min[8]。

1.2.3 搖瓶培養(yǎng)基

酵母浸粉 30 g·L-1，葡萄糖 80 g·L-1，玉米漿膏100 g·L-1， 七 水 硫 酸 鎂 0.6 g·L-1， 硫 酸 銨 15 g·L-1，磷 酸 二 氫 鉀 1.2 g·L-1， 黃 嘌 呤 0.05 g·L-1， 組 氨 酸0.03 g·L-1，pH值為7.0～7.2，滅菌壓力0.1 MPa，滅菌時間20 min[8]。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

酵母浸粉 50 g·L-1，葡萄糖 100 g·L-1，玉米漿膏120 g·L-1，七水硫酸鎂 0.6 g·L-1，硫酸銨 5 g·L-1，磷酸二氫鉀 1.2 g·L-1，檸檬酸鈉 2 g·L-1，黃嘌呤 0.05 g·L-1，組氨酸0.03 g·L-1，pH值為7.0～7.2，滅菌壓力0.1 MPa，滅菌時間20 min[8]。

1.3 儀器與設(shè)備

全自動發(fā)酵系統(tǒng)：WMC-9050L/A/S，上海萬木春生物工程有限公司，配備pH電極和DO電極；10 m3發(fā)酵罐：配有1 m3種子罐和5 m3補糖罐各一個；分光光度計：722N，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜系統(tǒng)：UltiMate 3000 HPLC，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；生物傳感分析儀：SBA-40E，山東省科學(xué)院生物研究所。

1.4 試驗方法

1.4.1 搖瓶發(fā)酵試驗

（1）菌種培養(yǎng)。取甘油菌種，接種于斜面培養(yǎng)基，在32 ℃條件下恒溫培養(yǎng)12 h，作為活化種子。

（2）搖瓶種子培養(yǎng)。接一環(huán)長勢良好的斜面菌種至20 mL種子培養(yǎng)基中，于500 mL三角瓶培養(yǎng)，采用旋轉(zhuǎn)式搖床，頻率180 r·min-1，溫度34 ℃，搖床培養(yǎng)12 h。

（3）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。將種子液按10%接種量接至20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于500 mL三角瓶培養(yǎng)，采用旋轉(zhuǎn)式搖床，頻率200 r·min-1，溫度36 ℃，搖床培養(yǎng)48 h。

1.4.2 自控發(fā)酵罐試驗

50 L自控發(fā)酵罐，接入發(fā)酵液10%比例的搖瓶培養(yǎng)種子液。發(fā)酵液裝量為30 L，滅菌溫度121 ℃，滅菌時間30 min，發(fā)酵溫度36 ℃，控制pH值=7.0，通氣攪拌培養(yǎng)。根據(jù)搖瓶發(fā)酵試驗結(jié)果，在50 L自控罐進(jìn)行發(fā)酵試驗，初始裝量30 L，底糖濃度為10%，補糖10 L，濃度為50%。考察次黃嘌呤添加方式、發(fā)酵分階段溶解氧控制與腺苷產(chǎn)量的關(guān)系。

（1）考察次黃嘌呤添加時機(jī)及方式與腺苷發(fā)酵的關(guān)系的試驗設(shè)計。實驗設(shè)計加入底料、一次性加入、分批次加入和流加補料4種添加方式。①加入底料的方式。在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入6 g·L-1的次黃嘌呤。②一次性加入的方式。在發(fā)酵18 h后一次性加入3 g·L-1的次黃嘌呤。③分批次加入的方式。分別在18 h、30 h加入3 g·L-1的次黃嘌呤。④流加補料的方式。在補糖液中加入次黃嘌呤質(zhì)量濃度為9 g·L-1，發(fā)酵18 h后持續(xù)流加。發(fā)酵過程中每隔6 h測定菌體濃度（OD600）和腺苷產(chǎn)量。

（2）分階段溶氧控制連續(xù)流加次黃嘌呤工藝對腺苷發(fā)酵的影響的試驗設(shè)計。實驗設(shè)計分階段溶氧控制連續(xù)流加、固定式溶氧控制連續(xù)流加、分階段溶氧控制未添加3種控制工藝。①分階段溶氧控制連續(xù)流加工藝。根據(jù)菌體的生長情況，分階段控制溶氧條件，在發(fā)酵前期（18 h前），控制溶解氧濃度在20%，在發(fā)酵中后期流加補料次黃嘌呤后，控制溶解氧濃度在10%～20%。②固定式溶氧控制連續(xù)流加工藝。在發(fā)酵全部過程中，控制溶解氧濃度在20%，在發(fā)酵中后期流加補料次黃嘌呤。③分階段溶氧控制未添加工藝。溶氧控制與分階段溶氧控制連續(xù)流加工藝相同，不同點為未添加次黃嘌呤。發(fā)酵過程中每隔6 h測定菌體濃度（OD600）、葡萄糖質(zhì)量濃度和腺苷產(chǎn)量。

1.4.3 10 m3發(fā)酵罐試驗

發(fā)酵罐材質(zhì)304，pH值、溫度自控，變頻器調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，體積10 m3，裝液體積6 m3，中控電腦顯示pH值、溶氧、溫度和轉(zhuǎn)速等參數(shù)，pH與液氨系統(tǒng)連鎖，自動調(diào)節(jié)控制。種子罐材質(zhì)304，pH值、溫度自控，變頻器調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，體積1 m3，裝液體積0.6 m3，中控電腦顯示pH值、溶氧、溫度和轉(zhuǎn)速等參數(shù)，pH與液氨系統(tǒng)連鎖，自動調(diào)節(jié)控制。

1.5 分析方法

（1）菌體濃度的測定。發(fā)酵液經(jīng)稀釋后，采用分光光度計檢測600 nm波長的OD值，計算菌體濃度。公式為：

式中：X1為菌體濃度（OD600值）；v1為樣品體積，mL；V1為稀釋后樣品體積，mL；A為稀釋后樣品OD值。

（2）葡萄糖質(zhì)量濃度的測定。利用生物傳感分析儀，進(jìn)行發(fā)酵上清液的檢測，計算葡萄糖質(zhì)量濃度。公式為：

式中：X2為葡萄糖質(zhì)量濃度，g·L-1；v2為樣品體積，mL；V2為稀釋后樣品體積，mL；c2為稀釋后樣品測定值，mg·dL-1。

（3）腺苷產(chǎn)量的測定。參考文獻(xiàn)[9]方法進(jìn)行檢測，計算腺苷產(chǎn)量。公式為：

式中：X3為腺苷產(chǎn)量，g·L-1；v3為樣品體積，mL；V3為稀釋后樣品體積，mL；c3為稀釋后樣品測定值，mg·L-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 次黃嘌呤質(zhì)量濃度對腺苷發(fā)酵的影響

徐海等[7]研究了次黃嘌呤對肌苷合成代謝的影響，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中的次黃嘌呤參與核苷代謝過程，添加次黃嘌呤利于半合成途徑肌苷的生成，在腺苷生物合成途徑中，次黃嘌呤是腺苷的合成前體。根據(jù)核苷酸補救途徑理論，發(fā)酵過程中添加前體，可以促進(jìn)腺苷的合成，提高發(fā)酵水平。試驗設(shè)計在腺苷搖瓶發(fā)酵18 h和30 h后，分別添加次黃嘌呤，考察次黃嘌呤質(zhì)量濃度對腺苷發(fā)酵的影響。

由圖1可知，次黃嘌呤的添加對腺苷的生物合成有促進(jìn)作用，隨著次黃嘌呤添加量的增加，腺苷產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)達(dá)到合適濃度后，再增加次黃嘌呤的濃度，腺苷發(fā)酵水平的增長幅度減小。因此選擇合適的濃度可以提高產(chǎn)量，即添加次黃嘌呤質(zhì)量濃度為3 g·L-1時，腺苷產(chǎn)量最高，可達(dá)15.1 g·L-1，比不添加次黃嘌呤的腺苷產(chǎn)量提高了29.06%。

圖1 次黃嘌呤質(zhì)量濃度對腺苷發(fā)酵的影響圖

2.2 50 L發(fā)酵罐添加次黃嘌呤的腺苷發(fā)酵試驗

2.2.1 次黃嘌呤添加時機(jī)及方式與腺苷發(fā)酵的關(guān)系

次黃嘌呤參與腺苷的合成代謝，培養(yǎng)基中次黃嘌呤的質(zhì)量濃度對腺苷發(fā)酵有重要的影響[8]。在發(fā)酵的不同階段，采用不同的方式添加次黃嘌呤，可以考察添加時機(jī)及添加方式對發(fā)酵的影響。

由圖2可知，培養(yǎng)基中加入次黃嘌呤，發(fā)酵前期，菌體快速生長，發(fā)酵0～24 h，4種添加方式的OD600值基本無差異，腺苷產(chǎn)量也基本一致。隨著發(fā)酵進(jìn)行，發(fā)酵30 h后，流加補料和分批添加的方式OD600值要優(yōu)于一次加入和底料添加的方式，這可能是因為菌體利用前體物質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率存在差異，流加補料或者分批補入次黃嘌呤的方式更有利于菌體生長，有利于產(chǎn)物的生成。腺苷的最終產(chǎn)量分別為28.4 g·L-1、29.5 g·L-1、31.0 g·L-1和 32.1 g·L-1，結(jié)果表明流加補料次黃嘌呤，利于發(fā)酵菌體生長和腺苷合成，腺苷產(chǎn)量高，可以達(dá)到 32.1 g·L-1。

圖2 次黃嘌呤添加時機(jī)及方式與腺苷發(fā)酵的關(guān)系圖

2.2.2 分階段溶氧控制連續(xù)流加次黃嘌呤工藝對腺苷發(fā)酵的影響

劉劍等[10]研究了溶解氧水平與發(fā)酵腺苷的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)分階段調(diào)節(jié)利于發(fā)酵培養(yǎng)腺苷生成，本文在此基礎(chǔ)也研究了分階段溶氧控制連續(xù)流加次黃嘌呤工藝對腺苷發(fā)酵的影響。由圖3可知，在發(fā)酵中后期，分階段溶氧控制連續(xù)流加次黃嘌呤工藝腺苷產(chǎn)量，明顯高于固定式溶氧控制連續(xù)流加次黃嘌呤工藝和分階段溶氧控制未添加次黃嘌呤工藝，分階段溶氧控制連續(xù)流加次黃嘌呤工藝最終腺苷產(chǎn)量為34.5 g·L-1，對比固定式溶氧控制連續(xù)流加次黃嘌呤工藝腺苷產(chǎn)量32.1 g·L-1提高了7.48%，對比分階段溶氧控制未添加次黃嘌呤工藝腺苷產(chǎn)量22.8 g·L-1提高了51.32%，分階段溶氧控制連續(xù)流加次黃嘌呤工藝腺苷產(chǎn)量有明顯的優(yōu)勢。

圖3 分階段溶氧控制連續(xù)流加次黃嘌呤工藝對腺苷發(fā)酵的影響圖

2.3 10 m3發(fā)酵罐添加次黃嘌呤的腺苷發(fā)酵試驗

在10 m3發(fā)酵罐進(jìn)行腺苷流加補料工藝放大試驗，補糖液中加入，次黃嘌呤質(zhì)量濃度為9 g·L-1，根據(jù)發(fā)酵過程分階段控制溶氧條件，取得穩(wěn)定的發(fā)酵結(jié)果。如表1所示，50 h左右發(fā)酵周期腺苷產(chǎn)量平均達(dá)35.06 g·L-1，工藝有較好的工業(yè)化價值。

表1 10 m3發(fā)酵罐添加次黃嘌呤的腺苷發(fā)酵試驗表

3 結(jié)論

本文研究了腺苷發(fā)酵添加前體物質(zhì)次黃嘌呤對發(fā)酵水平的影響，研究了次黃嘌呤前體物質(zhì)的質(zhì)量濃度與發(fā)酵產(chǎn)率的關(guān)系以及次黃嘌呤前體物質(zhì)加入方式與腺苷產(chǎn)量的關(guān)系，通過分階段控制溶氧條件，在搖瓶、50 L發(fā)酵罐、10 m3發(fā)酵中試罐進(jìn)行逐步試驗和放大，整合培養(yǎng)基優(yōu)化和溶解氧調(diào)節(jié)，提高了腺苷產(chǎn)量。研究結(jié)果表明在發(fā)酵過程的18 h和30 h分兩次補充3 g·L-1次黃嘌呤，可使腺苷產(chǎn)量大幅度提升；固定式溶氧控制連續(xù)流加次黃嘌呤的方式腺苷產(chǎn)量達(dá)到32.1 g·L-1；分階段溶氧控制連續(xù)流加次黃嘌呤工藝腺苷產(chǎn)量達(dá)到34.5 g·L-1；在10 m3中試發(fā)酵罐進(jìn)行補料流加工藝放大，流加補糖含9 g·L-1的次黃嘌呤，并通過階段控制溶氧條件，產(chǎn)量達(dá)到35.06 g·L-1，工藝有較好的工業(yè)化價值。