枯草芽孢桿菌產腺苷補料發酵工藝的研究

◎ 陳華強

（廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司，廣東 肇慶 526040)

腺苷（Adenosine）是一種核苷類物質，存在于不同類型的細胞中，是冬蟲夏草、靈芝及人參等名貴藥材的主要活性成分，在人體的核苷代謝和生理生化方面起著重要作用，在食品、保健品、醫藥和化工等領域有著廣泛的應用[1-2]。國內對腺苷的研究主要集中于菌株誘變篩選、發酵動力學研究、培養基優化等[3-5]。梅漫莉等[6]研究了黃嘌呤和谷氨酰胺對產腺苷的影響，通過底物添加、流加補料的發酵方式加入黃嘌呤、谷氨酰胺，有效地提高了腺苷的產量。根據核苷酸代謝的補救途徑，腺苷合成的前體物質為次黃嘌呤，因此在發酵過程中添加適量的前體物質次黃嘌呤可以增加腺苷的產率[7]。陳華強[8]研究了檸檬酸鈉與HMP代謝途徑中碳流量的關系以及次黃嘌呤對發酵產苷和發酵過程的影響，結果發現次黃嘌呤可以使腺苷發酵產量增加。本研究擬考察發酵液中次黃嘌呤前體物質的質量濃度與發酵產率的關系、次黃嘌呤前體物質加入方式與腺苷產量的關系，通過搖瓶、50 L發酵罐、10 m3發酵中試罐，整合補料與溶解氧的發酵過程調控，逐級放大試驗，以期為工業化應用研究開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 發酵菌種

發酵菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，組氨酸和黃嘌呤缺陷）AR090，由廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司分離和保藏。

1.2 培養基

1.2.1 斜面培養基

酵母膏 5.0 g·L-1，牛肉膏 10 g·L-1，氯化鈉 2.5 g·L-1，瓊脂 25 g·L-1，蛋白胨 4.0 g·L-1，pH 值為 7.0 ～ 7.2，滅菌壓力0.1 MPa，滅菌時間20 min[8]。

1.2.2 種子培養基

酵母膏 20 g·L-1，葡萄糖 20 g·L-1，硫酸銨 5 g·L-1，七水硫酸亞鐵0.01 g·L-1，磷酸二氫鉀3 g·L-1，七水硫酸鎂 0.3 g·L-1，七水硫酸錳 0.01 g·L-1，黃嘌呤 0.03 g·L-1，組氨酸0.03 g·L-1，pH值為7.0～7.2，滅菌壓力0.1 MPa，滅菌時間20 min[8]。

1.2.3 搖瓶培養基

酵母浸粉 30 g·L-1，葡萄糖 80 g·L-1，玉米漿膏100 g·L-1， 七 水 硫 酸 鎂 0.6 g·L-1， 硫 酸 銨 15 g·L-1，磷 酸 二 氫 鉀 1.2 g·L-1， 黃 嘌 呤 0.05 g·L-1， 組 氨 酸0.03 g·L-1，pH值為7.0～7.2，滅菌壓力0.1 MPa，滅菌時間20 min[8]。

1.2.4 發酵培養基

酵母浸粉 50 g·L-1，葡萄糖 100 g·L-1，玉米漿膏120 g·L-1，七水硫酸鎂 0.6 g·L-1，硫酸銨 5 g·L-1，磷酸二氫鉀 1.2 g·L-1，檸檬酸鈉 2 g·L-1，黃嘌呤 0.05 g·L-1，組氨酸0.03 g·L-1，pH值為7.0～7.2，滅菌壓力0.1 MPa，滅菌時間20 min[8]。

1.3 儀器與設備

全自動發酵系統：WMC-9050L/A/S，上海萬木春生物工程有限公司，配備pH電極和DO電極；10 m3發酵罐：配有1 m3種子罐和5 m3補糖罐各一個；分光光度計：722N，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；高效液相色譜系統：UltiMate 3000 HPLC，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；生物傳感分析儀：SBA-40E，山東省科學院生物研究所。

1.4 試驗方法

1.4.1 搖瓶發酵試驗

（1）菌種培養。取甘油菌種，接種于斜面培養基，在32 ℃條件下恒溫培養12 h，作為活化種子。

（2）搖瓶種子培養。接一環長勢良好的斜面菌種至20 mL種子培養基中，于500 mL三角瓶培養，采用旋轉式搖床，頻率180 r·min-1，溫度34 ℃，搖床培養12 h。

（3）搖瓶發酵培養。將種子液按10%接種量接至20 mL發酵培養基中，于500 mL三角瓶培養，采用旋轉式搖床，頻率200 r·min-1，溫度36 ℃，搖床培養48 h。

1.4.2 自控發酵罐試驗

50 L自控發酵罐，接入發酵液10%比例的搖瓶培養種子液。發酵液裝量為30 L，滅菌溫度121 ℃，滅菌時間30 min，發酵溫度36 ℃，控制pH值=7.0，通氣攪拌培養。根據搖瓶發酵試驗結果，在50 L自控罐進行發酵試驗，初始裝量30 L，底糖濃度為10%，補糖10 L，濃度為50%?？疾齑吸S嘌呤添加方式、發酵分階段溶解氧控制與腺苷產量的關系。

（1）考察次黃嘌呤添加時機及方式與腺苷發酵的關系的試驗設計。實驗設計加入底料、一次性加入、分批次加入和流加補料4種添加方式。①加入底料的方式。在發酵培養基中加入6 g·L-1的次黃嘌呤。②一次性加入的方式。在發酵18 h后一次性加入3 g·L-1的次黃嘌呤。③分批次加入的方式。分別在18 h、30 h加入3 g·L-1的次黃嘌呤。④流加補料的方式。在補糖液中加入次黃嘌呤質量濃度為9 g·L-1，發酵18 h后持續流加。發酵過程中每隔6 h測定菌體濃度（OD600）和腺苷產量。

（2）分階段溶氧控制連續流加次黃嘌呤工藝對腺苷發酵的影響的試驗設計。實驗設計分階段溶氧控制連續流加、固定式溶氧控制連續流加、分階段溶氧控制未添加3種控制工藝。①分階段溶氧控制連續流加工藝。根據菌體的生長情況，分階段控制溶氧條件，在發酵前期（18 h前），控制溶解氧濃度在20%，在發酵中后期流加補料次黃嘌呤后，控制溶解氧濃度在10%～20%。②固定式溶氧控制連續流加工藝。在發酵全部過程中，控制溶解氧濃度在20%，在發酵中后期流加補料次黃嘌呤。③分階段溶氧控制未添加工藝。溶氧控制與分階段溶氧控制連續流加工藝相同，不同點為未添加次黃嘌呤。發酵過程中每隔6 h測定菌體濃度（OD600）、葡萄糖質量濃度和腺苷產量。

1.4.3 10 m3發酵罐試驗

發酵罐材質304，pH值、溫度自控，變頻器調節轉速，體積10 m3，裝液體積6 m3，中控電腦顯示pH值、溶氧、溫度和轉速等參數，pH與液氨系統連鎖，自動調節控制。種子罐材質304，pH值、溫度自控，變頻器調節轉速，體積1 m3，裝液體積0.6 m3，中控電腦顯示pH值、溶氧、溫度和轉速等參數，pH與液氨系統連鎖，自動調節控制。

1.5 分析方法

（1）菌體濃度的測定。發酵液經稀釋后，采用分光光度計檢測600 nm波長的OD值，計算菌體濃度。公式為：

式中：X1為菌體濃度（OD600值）；v1為樣品體積，mL；V1為稀釋后樣品體積，mL；A為稀釋后樣品OD值。

（2）葡萄糖質量濃度的測定。利用生物傳感分析儀，進行發酵上清液的檢測，計算葡萄糖質量濃度。公式為：

式中：X2為葡萄糖質量濃度，g·L-1；v2為樣品體積，mL；V2為稀釋后樣品體積，mL；c2為稀釋后樣品測定值，mg·dL-1。

（3）腺苷產量的測定。參考文獻[9]方法進行檢測，計算腺苷產量。公式為：

式中：X3為腺苷產量，g·L-1；v3為樣品體積，mL；V3為稀釋后樣品體積，mL；c3為稀釋后樣品測定值，mg·L-1。

2 結果與分析

2.1 次黃嘌呤質量濃度對腺苷發酵的影響

徐海等[7]研究了次黃嘌呤對肌苷合成代謝的影響，發現發酵液中的次黃嘌呤參與核苷代謝過程，添加次黃嘌呤利于半合成途徑肌苷的生成，在腺苷生物合成途徑中，次黃嘌呤是腺苷的合成前體。根據核苷酸補救途徑理論，發酵過程中添加前體，可以促進腺苷的合成，提高發酵水平。試驗設計在腺苷搖瓶發酵18 h和30 h后，分別添加次黃嘌呤，考察次黃嘌呤質量濃度對腺苷發酵的影響。

由圖1可知，次黃嘌呤的添加對腺苷的生物合成有促進作用，隨著次黃嘌呤添加量的增加，腺苷產量逐漸增加，當達到合適濃度后，再增加次黃嘌呤的濃度，腺苷發酵水平的增長幅度減小。因此選擇合適的濃度可以提高產量，即添加次黃嘌呤質量濃度為3 g·L-1時，腺苷產量最高，可達15.1 g·L-1，比不添加次黃嘌呤的腺苷產量提高了29.06%。

圖1 次黃嘌呤質量濃度對腺苷發酵的影響圖

2.2 50 L發酵罐添加次黃嘌呤的腺苷發酵試驗

2.2.1 次黃嘌呤添加時機及方式與腺苷發酵的關系

次黃嘌呤參與腺苷的合成代謝，培養基中次黃嘌呤的質量濃度對腺苷發酵有重要的影響[8]。在發酵的不同階段，采用不同的方式添加次黃嘌呤，可以考察添加時機及添加方式對發酵的影響。

由圖2可知，培養基中加入次黃嘌呤，發酵前期，菌體快速生長，發酵0～24 h，4種添加方式的OD600值基本無差異，腺苷產量也基本一致。隨著發酵進行，發酵30 h后，流加補料和分批添加的方式OD600值要優于一次加入和底料添加的方式，這可能是因為菌體利用前體物質的轉化效率存在差異，流加補料或者分批補入次黃嘌呤的方式更有利于菌體生長，有利于產物的生成。腺苷的最終產量分別為28.4 g·L-1、29.5 g·L-1、31.0 g·L-1和 32.1 g·L-1，結果表明流加補料次黃嘌呤，利于發酵菌體生長和腺苷合成，腺苷產量高，可以達到 32.1 g·L-1。

圖2 次黃嘌呤添加時機及方式與腺苷發酵的關系圖

2.2.2 分階段溶氧控制連續流加次黃嘌呤工藝對腺苷發酵的影響

劉劍等[10]研究了溶解氧水平與發酵腺苷的關系，發現分階段調節利于發酵培養腺苷生成，本文在此基礎也研究了分階段溶氧控制連續流加次黃嘌呤工藝對腺苷發酵的影響。由圖3可知，在發酵中后期，分階段溶氧控制連續流加次黃嘌呤工藝腺苷產量，明顯高于固定式溶氧控制連續流加次黃嘌呤工藝和分階段溶氧控制未添加次黃嘌呤工藝，分階段溶氧控制連續流加次黃嘌呤工藝最終腺苷產量為34.5 g·L-1，對比固定式溶氧控制連續流加次黃嘌呤工藝腺苷產量32.1 g·L-1提高了7.48%，對比分階段溶氧控制未添加次黃嘌呤工藝腺苷產量22.8 g·L-1提高了51.32%，分階段溶氧控制連續流加次黃嘌呤工藝腺苷產量有明顯的優勢。

圖3 分階段溶氧控制連續流加次黃嘌呤工藝對腺苷發酵的影響圖

2.3 10 m3發酵罐添加次黃嘌呤的腺苷發酵試驗

在10 m3發酵罐進行腺苷流加補料工藝放大試驗，補糖液中加入，次黃嘌呤質量濃度為9 g·L-1，根據發酵過程分階段控制溶氧條件，取得穩定的發酵結果。如表1所示，50 h左右發酵周期腺苷產量平均達35.06 g·L-1，工藝有較好的工業化價值。

表1 10 m3發酵罐添加次黃嘌呤的腺苷發酵試驗表

3 結論

本文研究了腺苷發酵添加前體物質次黃嘌呤對發酵水平的影響，研究了次黃嘌呤前體物質的質量濃度與發酵產率的關系以及次黃嘌呤前體物質加入方式與腺苷產量的關系，通過分階段控制溶氧條件，在搖瓶、50 L發酵罐、10 m3發酵中試罐進行逐步試驗和放大，整合培養基優化和溶解氧調節，提高了腺苷產量。研究結果表明在發酵過程的18 h和30 h分兩次補充3 g·L-1次黃嘌呤，可使腺苷產量大幅度提升；固定式溶氧控制連續流加次黃嘌呤的方式腺苷產量達到32.1 g·L-1；分階段溶氧控制連續流加次黃嘌呤工藝腺苷產量達到34.5 g·L-1；在10 m3中試發酵罐進行補料流加工藝放大，流加補糖含9 g·L-1的次黃嘌呤，并通過階段控制溶氧條件，產量達到35.06 g·L-1，工藝有較好的工業化價值。