水產(chǎn)品中孔雀石綠快速檢測(cè)產(chǎn)品技術(shù)評(píng)價(jià)研究

◎ 張 凡，王一名，霍思宇，王海玲，余麗波，周 超，祁萌娜，余 洋

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176，2.中檢科（北京）測(cè)試認(rèn)證有限公司，北京 100176）

孔雀石綠（Malachite Green，MG），又稱苯胺綠、孔雀綠、品綠、中國(guó)綠，分子式為C23H25ClN2，是一種人工合成的三苯甲烷架構(gòu)的染料，因其外觀顏色呈孔雀綠而得名，由于其可以用來(lái)殺菌和防治寄生蟲而被作為防腐劑廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。孔雀石綠對(duì)人體免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)具有嚴(yán)重的致癌作用，而濫用孔雀石綠還可能誘發(fā)致病菌的耐藥性，對(duì)人體健康構(gòu)成潛在危害[1-3]。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2020年公布的第250號(hào)公告中，將孔雀石綠列為食品動(dòng)物中禁止使用的藥品，美國(guó)和歐盟也早已禁止在食用性動(dòng)物中使用孔雀石綠[4-5]。與其他抗真菌劑相比，由于其高效率、低成本和現(xiàn)成可用性，仍在世界許多地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用。

目前，關(guān)于孔雀石綠類化合物的檢測(cè)主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等檢測(cè)方法[6-7]。這些方法雖然準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、適用于定量檢測(cè)，但存在成本高、操作煩瑣、設(shè)備昂貴、操作人員需專業(yè)培訓(xùn)和檢測(cè)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，難以滿足基層現(xiàn)場(chǎng)快速篩查的需求。近年來(lái)，膠體金免疫層析技術(shù)發(fā)展迅速，具有前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、對(duì)操作人員技術(shù)水平要求低等優(yōu)點(diǎn)，適宜在基層推廣應(yīng)用，被認(rèn)為是目前最具應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展?jié)摿Φ目焖贆z測(cè)技術(shù)[8-10]。在原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局2017年第58號(hào)公告中，也發(fā)布了《水產(chǎn)品中孔雀石綠的快速檢測(cè) 膠體金免疫層析法》（KJ 201701），規(guī)定了快速檢測(cè)方法的相關(guān)技術(shù)要求。因此，為規(guī)范快速檢測(cè)的應(yīng)用，合理發(fā)揮快檢技術(shù)的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，有必要對(duì)該類快檢產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)[11-13]。

本研究選用含有孔雀石綠的魚肉、蝦肉質(zhì)控樣品及含有結(jié)晶紫和隱色結(jié)晶紫干擾物的添加樣品，對(duì)4個(gè)廠家的孔雀石綠快速檢測(cè)試紙條進(jìn)行測(cè)試，對(duì)檢出限、靈敏度、特異性、假陽(yáng)性率和假陰性率等進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為基層監(jiān)管工作人員選購(gòu)及應(yīng)用孔雀石綠快速檢測(cè)試紙條提供參考，推進(jìn)食品快檢技術(shù)在實(shí)際監(jiān)管中的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

含有孔雀石綠的魚肉、蝦肉質(zhì)控樣品[中檢科（北京）實(shí)驗(yàn)室能力評(píng)價(jià)有限公司]；魚肉、蝦肉陰性樣品為前期制備質(zhì)控樣過程中飼喂宰殺并經(jīng)國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)確認(rèn)的樣品；干擾物樣品為陰性樣品加標(biāo)并經(jīng)國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)確認(rèn)，均勻性穩(wěn)定性符合《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》（CNAS—GL003：2018）要求（結(jié)晶紫200 μg·kg-1）；評(píng)價(jià)用快速檢測(cè)產(chǎn)品，從市場(chǎng)上購(gòu)買4個(gè)廠家3個(gè)不同批次的快速檢測(cè)產(chǎn)品；結(jié)晶紫（純度99.0%以上，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，ME54.702，瑞士METTLER TOLEDO；均質(zhì)器，F(xiàn)A30，上海弗魯克；水浴氮吹儀，ANPEL DC，上海安譜；渦旋儀，Talboys，上海安譜；移液槍，2 ～ 20 μL，德國(guó) Eppendorf。

1.3 技術(shù)指標(biāo)要求

依據(jù)《水產(chǎn)品中孔雀石綠的快速檢測(cè) 膠體金免疫層析法》（KJ 201701）及中檢科（北京）測(cè)試認(rèn)證有限公司制定的《食品安全快速檢測(cè)產(chǎn)品評(píng)價(jià)指標(biāo)體系》，快速檢測(cè)產(chǎn)品性能指標(biāo)要求為檢出限≤2 μg·kg-1，靈敏度≥99%，特異性≥85%，假陰性率≤1%，假陽(yáng)性率≤15%，交叉反應(yīng)率≤0.1%，批內(nèi)重復(fù)性≥96.4%，批間重復(fù)性卡方計(jì)算＜3.84。

使用陰性空白樣品、1倍檢出限陽(yáng)性樣品質(zhì)控樣、2倍檢出限陽(yáng)性樣品質(zhì)控樣、干擾物質(zhì)檢出陽(yáng)性的最小濃度添加樣品，按照快速檢測(cè)說(shuō)明書規(guī)定的前處理方法和分析步驟進(jìn)行，并對(duì)所有結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)價(jià)快速檢測(cè)產(chǎn)品的相關(guān)指標(biāo)是否符合《食品安全快速檢測(cè)產(chǎn)品評(píng)價(jià)指標(biāo)體系》要求。

1.4 快檢產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)評(píng)價(jià)

1.4.1 檢出限評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)快檢產(chǎn)品的檢出限，本實(shí)驗(yàn)采用1倍檢出限濃度水平的魚肉和蝦肉陽(yáng)性樣品質(zhì)控樣進(jìn)行檢測(cè)，分別使用3個(gè)批次快檢產(chǎn)品，每個(gè)批次檢測(cè)50份魚肉和50份蝦肉樣品，嚴(yán)格按照快檢產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.2 靈敏度和假陰性率評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)快檢產(chǎn)品的靈敏度和假陰性率，本實(shí)驗(yàn)采用1倍檢出限濃度水平和2倍檢出限濃度水平的魚肉和蝦肉陽(yáng)性樣品質(zhì)控樣進(jìn)行檢測(cè)，分別使用3個(gè)批次快檢產(chǎn)品，每個(gè)批次檢測(cè)100份魚肉和100份蝦肉樣品，嚴(yán)格按照快檢產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算靈敏度和假陰性率。

1.4.3 特異性和假陽(yáng)性率評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)快檢產(chǎn)品的特異性和假陽(yáng)性率，本實(shí)驗(yàn)采用魚肉和蝦肉陰性空白樣品進(jìn)行檢測(cè)，分別使用3個(gè)批次快檢產(chǎn)品，每個(gè)批次檢測(cè)40份魚肉和40份蝦肉樣品，嚴(yán)格按照快檢產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算特異性和假陽(yáng)性率。

1.4.4 交叉反應(yīng)評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)快檢產(chǎn)品的交叉反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)采用干擾物質(zhì)檢出陽(yáng)性的最小濃度的魚肉和蝦肉樣品進(jìn)行檢測(cè)，分別使用3個(gè)批次快檢產(chǎn)品，每個(gè)批次檢測(cè)20份魚肉和20份蝦肉樣品，嚴(yán)格按照快檢產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算交叉反應(yīng)率。

1.4.5 批內(nèi)重復(fù)性評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)快檢產(chǎn)品的批內(nèi)重復(fù)性，本實(shí)驗(yàn)采用魚肉和蝦肉陰性空白樣品、1倍檢出限濃度水平和2倍檢出限濃度水平的魚肉和蝦肉陽(yáng)性樣品質(zhì)控樣進(jìn)行檢測(cè)，使用1個(gè)批次快檢產(chǎn)品檢測(cè)140份魚肉和140份蝦肉樣品，嚴(yán)格按照快檢產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算批內(nèi)重復(fù)性。

1.4.6 批間重復(fù)性評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)快檢產(chǎn)品的批間重復(fù)性，本實(shí)驗(yàn)采用魚肉和蝦肉陰性空白樣品、1倍檢出限濃度水平和2倍檢出限濃度水平的魚肉和蝦肉陽(yáng)性樣品質(zhì)控樣進(jìn)行檢測(cè)，使用3個(gè)批次快檢產(chǎn)品，每個(gè)批次檢測(cè)140份魚肉和140份蝦肉樣品，嚴(yán)格按照快檢產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算批間重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

本次評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)選取市面流通中認(rèn)知度較高的4種基于膠體金原理的孔雀石綠快速檢測(cè)產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。在評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)前，檢查所有快速檢測(cè)產(chǎn)品的包裝、說(shuō)明書及配套試劑，均包裝密封完好，距離產(chǎn)品到期日4個(gè)月以上。此次評(píng)價(jià)用基質(zhì)及檢測(cè)限與產(chǎn)品說(shuō)明書契合。嚴(yán)格按照說(shuō)明書規(guī)定的操作步驟及方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表1、表2。

表2 評(píng)價(jià)指標(biāo)計(jì)算結(jié)果表

評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，4個(gè)廠家產(chǎn)品中，只有Ⅰ廠家產(chǎn)品所有指標(biāo)符合要求；對(duì)于靈敏度和批內(nèi)重復(fù)性，只有Ⅰ廠家產(chǎn)品檢測(cè)的兩種基質(zhì)均符合要求，其余3個(gè)廠家產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果靈敏度均＜99%，批內(nèi)重復(fù)性＜96.4%，不符合相應(yīng)指標(biāo)要求；對(duì)于特異性，4個(gè)廠家產(chǎn)品檢測(cè)的兩種基質(zhì)均≥85%，滿足相應(yīng)指標(biāo)要求；對(duì)于交叉反應(yīng)率實(shí)驗(yàn)，只有Ⅰ廠家產(chǎn)品說(shuō)明書提到，其余3個(gè)廠家均未提到，因此其余3個(gè)廠家未做交叉反應(yīng)率實(shí)驗(yàn)；對(duì)于批間重復(fù)性，除Ⅳ廠家產(chǎn)品不符合要求外，其余3個(gè)廠家均滿足批內(nèi)重復(fù)性指標(biāo)要求；另外對(duì)于不同的檢測(cè)基質(zhì)，同一廠家產(chǎn)品的檢測(cè)效果也存在差異，如II廠家產(chǎn)品的魚肉靈敏度為98.7%，不滿足要求，而蝦肉靈敏度為99.3%，滿足靈敏度指標(biāo)要求。

3 結(jié)論與討論

（1）此次評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，4個(gè)廠家的快速檢測(cè)產(chǎn)品均具有國(guó)內(nèi)相關(guān)機(jī)構(gòu)出具的產(chǎn)品評(píng)價(jià)報(bào)告，相關(guān)性能指標(biāo)顯示較好。但在此次驗(yàn)證評(píng)價(jià)的過程中，部分品牌出現(xiàn)性能指標(biāo)不理想的情況，反映出國(guó)內(nèi)目前在售的快速檢測(cè)產(chǎn)品與送樣評(píng)價(jià)的快速檢測(cè)產(chǎn)品存在一定的差異性，單純采購(gòu)前一次評(píng)價(jià)并不能代表全部生產(chǎn)線產(chǎn)品質(zhì)量，應(yīng)引入合格評(píng)定的概念，由專業(yè)的機(jī)構(gòu)開展全鏈條產(chǎn)品質(zhì)量考察及定期監(jiān)督檢驗(yàn)，供用戶參考選購(gòu)。

（2）國(guó)內(nèi)目前在開展相關(guān)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)過程中，絕大部分機(jī)構(gòu)參照《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》（CNAS—GL003：2018），制備均勻性和穩(wěn)定性符合要求的基質(zhì)加標(biāo)樣品，也有部分機(jī)構(gòu)使用沒有添加樣品基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液。前者的制備成本較大，后者則忽略了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)快速檢測(cè)產(chǎn)品的影響。因此，在開展評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)過程中，推薦使用的樣品為含有待測(cè)目標(biāo)物的有證基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者生產(chǎn)的含有待測(cè)目標(biāo)物的基質(zhì)質(zhì)控樣品或含有待測(cè)目標(biāo)物且均勻性和穩(wěn)定性滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求并經(jīng)過參比方法定值的實(shí)際樣品或基質(zhì)加標(biāo)樣品。

（3）在此次評(píng)價(jià)的4種產(chǎn)品中，僅1種產(chǎn)品在說(shuō)明書中提示了產(chǎn)品的交叉反應(yīng)，可能存在部分廠家對(duì)交叉反應(yīng)的重視不夠的情況。產(chǎn)品說(shuō)明書中應(yīng)明確提示交叉反應(yīng)情況，以便用戶在開展快速檢測(cè)時(shí)對(duì)檢測(cè)樣品及檢測(cè)結(jié)果做出恰當(dāng)?shù)呐袛唷?/p>