食品中沙門氏菌的測定能力驗證結果分析

◎ 朱偉珍，李慶香，巫熙凌

（廣東省汕頭市質量計量監督檢測所，廣東 汕頭 515041）

沙門氏菌是最常見的人畜共患食源性致病菌之一，屬腸桿菌科，革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于自然界，易污染水源、各類食品和禽畜產品等，嚴重危害人類健康，易引起諸如傷寒、急性腸胃炎、敗血病等疾病[1]。據統計，在世界各國的種類細菌性食物中毒，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首，我國內陸地區也以沙門氏菌為首位。沙門氏菌的感染問題已經成為一個備受關注的公共衛生問題，沙門氏菌的預防和有效控制也受到越來越多的重視。我國《食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）也明確規定在各類食品中沙門氏菌均不得檢出，沙門氏菌的檢測已作為食品檢測的常規項目[2-4]。

實驗室能力驗證是利用實驗室間比對來確定實驗室檢測能力的活動，是檢驗實驗室檢測水平的一項重要手段。通過能力驗證項目的實施，可以加強實驗室間的技術交流，提高檢驗檢測的質量和水平。為驗證實驗室是否具備檢測沙門氏菌的技術能力，確保檢測活動的有效性，本實驗室參加了由大連中食國實檢測技術公司組織的《CFAPA-1186 食品中沙門氏菌的測定能力驗證計劃》，按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）的檢測要求對盲樣進行檢測，同時對能力驗證實驗的過程與結果進行分析討論，總結出沙門氏菌能力驗證實驗和日常檢驗的注意事項，以期為相關檢測提供參考[5]。

1 材料與方法

1.1 樣品

編號分別為沙門定性019、沙門定性390、沙門定性418樣品（以下簡稱019、390、418），采用真空西林瓶密閉包裝，購自大連中食國實檢測技術有限公司；標準菌株：鼠傷寒沙門氏菌標準菌株，CMCC（B）50115，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要培養基和試劑

緩沖蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）、腦心浸出液肉湯（Brain Heart Infusion Broth，BHI）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（Tetrathionate Brilliant Green Enrichment Medium Base，TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（Selenite Cystine Broth，SC）、亞硫酸鉍瓊脂（Bisulfite Sulfite Agar，BS）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（Xylose Lysine Deoxycholate Agar，XLD）、HE瓊脂（Hektoen Enteric Agar，HE）、沙門氏菌顯色培養基（Chromogenic Salmonella Agar，SA）、三糖鐵瓊脂（Triple Sugar Iron Agar，TSI）、營養瓊脂（Nutrient Agar，NA）、革蘭氏染色液及沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒，以上培養基和試劑均購自廣東陸橋技術股份有限公司并通過驗證合格且在有效期內。

1.3 主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫療器械有限公司）；生物安全柜（蘇州凈化設備有限公司）；電恒溫培養箱（上海博迅實業有限公司）；顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 檢測依據

依據能力驗證組織單位提供的作業指導書和《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016），對編號019、390、418的樣品進行檢驗，另外增設一組以腦心浸出液肉湯（BHI）代替緩沖蛋白胨水（BPW）作為預增菌液，其余選擇性增菌、分離、生化鑒定試驗步驟按國家標準進行，同時設置陽性對照和空白對照。

1.4.2 樣品處理

收到的樣品為西林瓶包裝，樣品到達實驗室后，按參試作業指導書要求對樣品進行處理，于生物安全柜內，無菌開啟西林瓶，用40 mL稀釋液對樣品進行再水化。具體操作為先從40 mL無菌生理鹽水稀釋液中吸取4 mL加入西林瓶對樣品進行再水化，待凍干粉充分溶解后，用無菌吸管轉移至無菌瓶中，再反復5次，每次以4 mL稀釋液清洗西林瓶內壁，將清洗液全部收集于上述無菌瓶中，再將剩余稀釋液吸出合并到無菌瓶中，此為樣品待測原液，共40 mL。以此方法分別對另外2個樣品進行前處理。

1.4.3 預增菌

在生物安全柜中吸取25 mL待測樣品原液至225 mL滅菌BPW中，另吸取10 mL加入到預先準備好的90 mL滅菌的BHI中，同時吸取250 μL、100 μL鼠傷寒沙門氏菌（CMCC（B）50115）菌液分別加入到225 mL已滅菌的BPW和90 mL已滅菌的BHI作為陽性對照，并設置空白對照。將所有樣品和陽性對照、空白對照一起放進（36±1）℃的恒溫培養箱恒溫培養18～24 h。

1.4.4 選擇性增菌

輕輕搖動培養后的樣品混合液，分別吸取1 mL轉接到10 mL的亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）和四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）中，SC混合液于（36±1）℃恒溫培養箱恒溫培養18～24 h，TTB混合液于（42±1）℃恒溫培養箱恒溫培養18～24 h。以此方法，分別對另外2個樣品及陽性對照和空白對照進行預增菌與增菌。

1.4.5 選擇性分離

用接種環各取1環增菌液，劃線接種于BS、XLD、HE瓊脂平板和沙門氏菌顯色培養基平板各2個，BS瓊脂平板置于（36±1）℃恒溫培養箱恒溫培養24～48 h，HE、XLD瓊脂平板、沙門氏菌顯色培養基平板置于（36±1）℃恒溫培養箱恒溫培養18～24 h。以此方法，分別對另外2個樣品及陽性對照和空白對照進行劃線分離。培養結束后，觀察各個平板上有無可疑沙門氏菌菌落生長。

1.4.6 生化鑒定試驗

自BS、XLD、HE瓊脂平板、沙門氏菌顯色培養基平板上挑取2個以上典型或可疑菌落于營養瓊脂平板上純化，接種三糖鐵瓊脂，在斜面劃線，于底層穿刺。取營養瓊脂平板上面純化的適量菌落到生理鹽水稀釋液中，制成與沙門氏菌干制生化試劑盒里面提供的比濁管相當濁度的菌懸液，接種于沙門氏菌干制生化試劑。三糖鐵瓊脂和沙門氏菌干制生化試劑（36±1）℃恒溫培養箱恒溫培養24～48 h。陽性對照在以上4種分離鑒定平板上面挑取典型菌落采用同樣操作。

2 結果與分析

2.1 預增菌與增菌結果

由表1知，019、390、418及陽性對照通過增菌培養后，BPW增菌液和BHI增菌液均變為渾濁；TTB變渾濁，稍變黃色，SC變渾濁、呈紅色。空白對照的BPW增菌液和BHI增菌液清澈，TTB、SC不變色。

2.2 選擇性分離培養基培養結果

019、390、418 、陽性對照在BS、XLD、HE瓊脂平板上面均有可疑或典型菌落，019、390在沙門氏菌顯色培養基平板上面沒有可疑菌落，418和陽性對照在沙門氏菌顯色培養基平板上面為紫紅色典型菌落，詳見表1。

表1 樣品增菌結果及選擇性分離平板菌落特征表

2.3 生化培養結果

根據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）中的表3，019、390 2個樣品在BS、HE瓊脂平板上面挑取的可疑菌落（分別以019-1、390-1、019-2、390-2標記），尿素、賴氨酸脫羧酶2項生化反應不符合A1典型反應，判定非沙門氏菌；根據標準中表2，在XLD瓊脂平板上面挑取的可疑菌落（分別以019-3、390-3標記），三糖鐵、賴氨酸脫羧酶試驗結果與沙門氏菌屬的生化反應不同，綜合判定2個樣品未檢出沙門氏菌。418在XLD瓊脂平板和沙門氏菌顯色培養基平板上面挑取的典型菌落（分別以418-1、418-2表示）和陽性對照在XLD、沙門氏菌顯色培養基平板上面挑取的典型菌落（分別以陽-1、陽-2表示）的生化反應均符合標準中表3中的A1典型反應，判定檢出沙門氏菌，詳見表2。

表2 SA、BS、XLD、HE瓊脂平板平板上典型或可疑菌落生化鑒定結果表

3 結論與討論

本次檢驗結果與能力驗證組織單位結果一致，結果滿意。能力驗證是保證實驗室檢測結果質量的重要手段，能力驗證結果可以很好地反映檢測實驗室的準確性和可靠性，各實驗室可以通過參加國家及各省級的能力驗證組織單位的實驗室能力驗證實驗，監測實驗室的運行動態和提高實驗室的檢測能力和水平[6-7]。同時，通過能力驗證實驗的交流和總結，可以發現日常檢測工作中容易忽視的問題，并加以改正，從而確保檢驗結果的準確性和可靠性。

沙門氏菌的能力驗證工作較為復雜，對檢測人員的操作水平和檢測經驗要求極高。在檢測過程中，務必規范操作，控制好各個檢測環節，提高實驗的成功率。①在收到樣品后，應根據自己的理論知識和工作經驗，盡快制訂詳細的檢驗方案。②可采用化學指示測試條對生理鹽水、培養基及其他檢驗材料的濕熱滅菌效果進行監測，防止因實驗樣品被污染而造成無法補救的后果。③在預增菌、選擇性增菌、分離和生化試驗等各個環節，應先對樣品進行檢測，再處理陽性對照，防止樣品間相互污染，并且防止陽性對照污染到樣品，從而影響結果的準確性。④三糖鐵瓊脂須自制備成高層斜面，不要使用安瓿瓶的三糖鐵，避免生化反應產硫化氫嚴重時觀察不到底層的反應結果。⑤進行生化試驗時，國家標準流程要求從選擇分離平板上挑取2個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵、賴氨酸和營養瓊脂，如果三糖鐵和賴氨酸結果不能排除，那么再做其他生化，實驗時間是2 d。這里最大的困難是1個單菌落可能不夠接種3種培養基。而且初篩的作用有限，表中能排除的2項，菌落在平板上都不是最典型的沙門氏菌特征。所以建議第1 d先純化，第2 d用純化后的菌將所有生化用沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒一起做，時間上與國家標準一樣，都是2 d得到完整的生化結果。而且菌經過純化，排除了選擇分離平板對生化的干擾，又獲得了大量的單菌落，既能滿足生化試驗的用菌量，也能為后面可能需要做血清試驗做準備。⑥從選擇性平板挑取可疑菌落進行純化時盡量多挑取幾個不同形態的可疑菌落，避免漏檢。

本次能力驗證實驗，在預增菌環節，3個盲樣按參試作業指導書制備出來的樣品量各有40 mL，按國家標準方法樣品檢測量只夠各取25 mL各設一組樣品的預增菌，本次研究在國家標準法的基礎上，增加一組用BHI作為預增菌液相當于對樣品平行檢測，防止只用BPW增菌達不到預期的增菌效果。BHI可用于金黃色葡萄球菌的純培養，也可用于營養苛求菌的培養（陸橋官方網站產品介紹），本實驗室在一次CNAS資質認定混合菌種盲樣鑒定中用其作為樣品的前增菌液，鑒定出沙門氏菌、單核細胞李斯特菌和銅綠假單胞菌，是一種可以活化多類標準菌種的增菌液，在本次實驗也再一次驗證了其對沙門氏菌預增菌效果跟BPW相當。

沙門氏菌的選擇性分離培養基尤其重要，其選擇性檢出效果均有不同。通常來講，1種培養基不可能適合所有的沙門氏菌，國家標準法也明確對沙門氏菌篩選需要用2種不同分離培養基。在國家標準法提到4種選擇性分離培養基平板中，BS、HE、和XLD瓊脂平板按照GB 4789.4—2016中的表1，沙門氏菌屬在上面的菌落特征典型與非典型加起來最少有3種特征，為防漏檢，當分離出來的菌落特征為表征時，也只能挑取，通過生化試驗進行區分，這樣一來工作量也非常大。而沙門氏菌顯色培養基按說明書上面只有紫紅色1種菌落特征，極其直觀。本次能力驗證試驗采用BS、XLD、HE瓊脂和沙門氏菌顯色培養基4種培養基對沙門氏菌進行分離，由表1和表2可見，2個未檢出沙門氏菌的樣品019和390，用沙門氏菌顯色培養基平板分離出來均為藍綠色和無色透明菌落，對照其說明書即明顯為無可疑菌落，也無需再做下一步的生化試驗。而用BS和XLD平板分離出來的菌落無法排除可疑菌落，為防漏檢，必須做下一步的生化試驗，但生化試驗結果都不是沙門氏菌。再看檢出沙門氏菌的418樣品，采用沙門氏菌顯色培養基平板分離出來的為藍綠色菌落和紫紅色菌落，按其菌落特征只有一種可疑菌落，而使用BS、XLD和HE平板分離出來的菌落卻有2種可疑菌落。由此可見，沙門氏菌顯色培養基的分離效果最為明顯。沙門氏菌顯色培養基專門為沙門氏菌設計，可以抑制雜菌生長，有研究表明，沙門氏菌顯色培養基的敏感性和特異性明顯高于BS、XLD和HE，在本次能力驗證實驗同樣得到驗證。因此，建議在日常的沙門氏菌檢驗中，可以采用沙門氏菌顯色培養基作為首選培養基，更方便高效地把目標菌和干擾菌區分開[8]。

目前，沙門氏菌的檢測方法較多，條件較好的實驗室可以采用聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PRC）、酶聯免疫反應、全自動細菌鑒定系統等方法結合國家標準法，以提高檢測質量和效率，而對于檢測條件有限的基層單位，單純采用傳統國家標準方法，符合食品安全法的強制標準，方法成熟可靠，同樣可以完成沙門氏菌的檢測工作。

通過此次能力驗證，本實驗室的檢驗能力得到了有效的驗證。參加完能力驗證之后，實驗室開展了能力驗證實驗結果分析，并總結經驗，提高了檢測人員的檢測能力和技術水平。