不同收割時間下人工濕地蘆葦根系分泌物的組成和特征

王俊力，劉福興*，付子軾，喬紅霞，陳桂發

1. 上海市農業科學院，上海 201403

2. 上海低碳農業工程技術研究中心，上海 201415

3. 上海十方生態園林股份有限公司，上海 200233

植物通過不同策略適應周圍環境并做出反應，包括從根部向環境中分泌和釋放各種化合物，即根系分泌物[1]. 根系分泌物作為植物與根際微生物相互作用的媒介，不僅可以通過改變生長環境的理化條件來調節植物性狀，促進營養吸收，還可以為根際微生物提供碳源和能源[2]，并影響微生物的群落結構及其驅動的碳、氮循環反應[3-4]. 植物種類、生長階段等自身因素以及環境、生長條件變化等外界因素均會影響根系分泌物的組成和含量[5-6].

蘆葦(Phragmites australis)是濕地生態系統中的主要植物之一，全球分布廣泛，在我國的亞熱帶季風氣候區，蘆葦通常在3月出芽，11月進入枯萎期[7]. 研究發現，枯萎期蘆葦地上部分生長速度緩慢甚至停滯，地下根仍然生長[8]，但是由于光合作用減弱，會抑制氧氣和有機物向根部輸送，導致根系分泌物發生變化從而影響植物生長狀況和根際微生物的結構及功能[9]；根系分泌物在植物生長初期分泌量最大，進入枯萎期后，逐漸降低，從而影響根際微生物活動，進而影響濕地中污染物的去除[10]. 收割是濕地植物最主要的管理措施之一，最優收割時間的研究對于平衡植物在濕地系統中的功能發揮、冬季濕地的污染物去除以及收割時人力、物力等有限資源的合理分配均具有重要意義. 研究[7,11-12]表明，枯萎期不同時間收割會影響蘆葦濕地的脫氮效果、蘆葦地上與地下部分的養分分配以及根系的呼吸代謝特征等. 而收割時間對枯萎期蘆葦根系分泌物釋放的影響、根系分泌物的組成和特征與污染物去除效果的關系等方面研究還鮮見報道. 該研究系統探討了枯萎期不同收割時間情況下蘆葦根系分泌物的組成和特征變化，及其與濕地總有機碳(TOC)和總氮(TN)去除率之間的關系，以期探索收割時間對植物根系分泌物的調控機制，指導蘆葦收割的最佳時間，對人工濕地植物的維護與管理具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗研究位于上海市農業科學院莊行綜合試驗基地(30°53′N、121°23′E). 該區屬亞熱帶季風氣候，多年平均降水量1 191.5 mm，蒸發量1 236.8 mm，年均溫度16.1 ℃. 全年日照時數1 900.2 h，無霜期224.4 d.

1.2 試驗設計

試驗采取模擬蘆葦濕地的方式進行，構建12個相同結構的傳統水平潛流濕地系統(見圖1)，長、寬、深分別為150 cm×50 cm×80 cm，進水端及出水端各設置長度為20 cm的布水區和集水區，并設有出水管，填料區長度為110 cm. 進出水均采用穿孔板，出水孔與出水管底標高一致. 為便于測定濕地內部的水質參數，在系統中間沿程豎向設置內徑5 cm穿孔管. 填料粒徑為1~2 cm的礫石，層深70 cm，運行時水在介質表面以下流動，水深為60 cm.

圖 1 蘆葦濕地試驗系統示意Fig.1 Schematic diagram of a single reed wetland monitored experiment system

植物采用當地常見蘆葦(Phragmites australis)，選取長勢相近的蘆葦幼苗移栽至根袋(300目尼龍網袋，20 cm×30 cm)中，袋內填料與袋外相同，系統內的初始種植密度為2株/袋(約29株/m2)，蘆葦在系統中培養約2個月待長勢平穩后，開始進水. 進水利用河道水配置，用尿素調節進水ρ(TN)，2年的進水ρ(TN)不同，第1年(2017年7月-2018年3月)較高(17.60~34.65 mg/L)，第2年(2018年8月-2019年4月)較低(3.16~10.03 mg/L)，進水水質參數如表1所示. 利用恒流泵進行連續進水，水力負荷(HLR)為100 mm/d，水力停留時間(HRT)為2.4 d. 系統運行約1個月趨于穩定后，正式開始試驗，第1年試驗結束后，重新布置第2年試驗.

表 1 試驗期間進水水質情況Table 1 Influent water quality during the experiment

研究地區的蘆葦在11月末地上部分的營養物質會逐漸向地下部分轉移[11]，該試驗設置4個處理，即W1(對照，蘆葦不收割)、W2〔枯萎前(10月)收割，營養物質轉移前〕、W3〔枯萎中期(12月)收割，休眠期〕、W4〔枯萎末期(翌年2月)收割，出芽前〕，每個處理3次重復，各個時期植物生長狀況詳見Wang等[11]的研究. 收割方式為去除濕地系統表面10 cm以上的植物部分，并定期對凋落物進行清理. 以收割為節點將每年的試驗分為4個階段，具體時間范圍如表2所示.2年試驗各階段的濕地TN去除率如表3所示，具體參見王俊力等[7]的研究.

表 2 試驗期間關鍵時間節點Table 2 Key time nodes during the experiment

表 3 試驗各階段不同收割時間下濕地TN去除率變化[7]Table 3 Wetland TN removal efficiency of different harvest time treatments under different experimental stages[7]

1.3 取樣與測定

水體取樣進出水同時進行，進水在布水區采集(3個重復)，出水在每個濕地系統的出水口采集，每月一次(階段1)，當收割開始后，每月2次(階段2、3、4)，并現場測定系統水體中的pH、ORP、EC、DO濃度、溫度(T)等指標.ρ(TOC)使用TOC分析儀(Apollo 9 000，Teledyne，美國)測定.

根系分泌物取樣在每次收割時和試驗結束時進行，方法是將根袋從系統中拿出，稱取根袋內與植物根系結合緊密(根際區)的基質100 g(鮮質量)，在預冷無菌水沖洗、搖床振蕩、過膜(0.45 μm)后，用甲醇萃取，固相萃取小柱采用Supelclean ENVI-18，經活化、上樣、淋洗、洗脫、干燥后，氮氣吹掃洗脫液濃縮定容至1 mL，用氣相色譜-質譜聯用儀(GCMS-QP2010，Shimadzu，日本)分析.

GC-MS分析條件：色譜條件為毛細管柱Rtx-5MS(30.0 m×0.32 mm×0.25 μm)；柱溫50 ℃保持2 min，以6 ℃/min的速率升至250 ℃，保持10 min；進樣口溫度為230 ℃，載氣He，采用不分流進樣方式，流速為2.4 mL/min，進樣量為1 μL. 質譜條件為EI電離方式，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，采用Scan采集方式，質量范圍45~550 amu，掃描時間間隔0.2 s.樣品質譜圖與數據庫(NIST11/NIST11s)進行相似度檢索，保留相似度≥80%且2年試驗和各處理的3次重復中均檢出的組分進行后續分析.

1.4 數據處理

采用峰面積歸一法計算根系分泌物含量，計算方法如下：

式中：R為各檢測組分相對含量(相似度80%以上物質)，%；A為各檢測組分的峰面積(相似度80%以上物質)，a.u.；At為檢測組分總的峰面積(相似度80%以上所有物質)，a.u..

利用IBM SPSS 22.0軟件對各參數進行統計分析，顯著性檢驗采用Duncan在0.05顯著性水平下進行；用SigmaPlot 12.5軟件作圖；用Canoco 5.0軟件進行冗余分析.

2 結果與分析

2.1 枯萎期蘆葦收割時間對濕地水體TOC的影響

從進出水ρ(TOC)(見圖2)可以看出，第1年進水ρ(TOC)較高(11.71~19.27 mg/L)，第2年較低(3.28~10.64 mg/L)；經蘆葦濕地處理后，2年間的各處理出水ρ(TOC)均低于進水.

圖 2 不同收割時間處理下蘆葦濕地的進水ρ(TOC)和TOC平均去除率Fig.2 TOC inflow concentration and removal efficiency of the reed wetlands under different harvest time treatments

2年試驗不收割處理的TOC平均去除率相似，第1年為29.6%±16.3%，第2年為29.0%±22.2%. 與W1處理相比，W2處理階段2的TOC平均去除率分別下降了36.7%(第1年)和7.3%(第2年)，隨著時間延長，去除率降低趨勢逐漸減小，階段4則分別增加了6.1%(第1年)和55.7%(第1年)；W3處理階段3和階段4的TOC平均去除率在第1年均與W1處理相當，第2年則分別增加了40.9%和54.7%；W4處理階段4的TOC平均去除率在第1年和第2年分別增加了29.2%和102.9%.

2.2 枯萎期蘆葦收割時間對根系分泌物組成的影響

對2年試驗和各處理3次重復中均檢出的化合物組分進行分析，共檢出10類35種化合物(見表4)，包括16種烷烴、5種酯、3種酮(含4-羥基-4-甲基-2-戊酮)、3種酸、2種醇、2種硅烷以及酚、醛、酰胺、噻唑各1種. 烷烴類化合物在種類數量上占優勢地位(占比為45.7%)，結構特征上均為鏈狀結構，其中正構烷烴7種，支鏈烷烴9種.

進一步分析不同處理檢出的化合物數量(見圖3)，2年試驗各處理檢出的化合物數量均大于20，且每個采樣時期收割處理檢出的化合物數量均少于不收割處理. 試驗2年同期相比，第1年前2次采樣檢出的化合物數量均高于第2年，后2次采樣則相反. 與W1處理相比，2年試驗W2處理后均使烷烴數量明顯減少，隨著時間的延長，烷烴數量逐漸增加；2年試驗W3和W4處理后均表現出烷烴數量增加的趨勢. 其余種類化合物由于數量較少，在收割時間處理下的數量變化無明顯規律.

2.3 枯萎期蘆葦收割時間對根系分泌物相對含量的影響

以色譜圖中檢出的組分峰面積來比較各處理的根系分泌物總量(見圖4)，2年試驗的不同收割時間處理后，根系分泌物總量的變化趨勢不同. 第1年，與不收割處理相比，收割處理均降低了蘆葦根系分泌物總量，越早收割降低越為明顯；第2年，W2和W4處理降低了剛收割后的根系分泌物總量，W3處理則增加了剛收割后的根系分泌物總量，但隨著時間的延長，又低于W1處理.

第1年各處理根系分泌物中，烷烴類相對含量最高(45.9%~81.2%)，其次為酸類(5.1%~22.8%)和脂類(7.8%~12.9%)，與其他類型化合物相比達到差異顯著水平(P＜0.05)；第2年，酸類相對含量最高(32.4%~62.6%，P＜0.05)，其次為烷烴類(12.5%~43.6%，P＜0.05).不同處理間比較，第1年，與W1處理相比，W2、W3和W4處理后均表現出烷烴類相對含量增加而酸類相對含量減少的趨勢；第2年，W2處理后表現為酸類相對含量增加而烷烴類減少，隨著時間的延長烷烴類又逐漸增加，W3處理后酸類和烷烴類相對含量均增加，W4處理后則表現為酸類相對含量減少而烷烴類增加的趨勢.

表 4 不同收割時間處理下蘆葦根系分泌物組成Table 4 Composition of reed root exudates under different harvest time treatment

2.4 濕地TOC和TN去除率與蘆葦根系分泌物的關系

用RDA分析濕地TOC和TN去除率與蘆葦根系分泌物的相互關系，以根系分泌物各類型含量(標準化峰面積)為環境變量，解釋濕地TOC和TN去除率的變化(見圖5). 試驗第1年，烷烴類含量對濕地TOC和TN去除率的單獨和條件效應解釋量最高(48.8%)，二者與烷烴類含量均呈顯著正相關(P＜0.05)；試驗第2年，酸類含量對濕地TOC和TN去除率的單獨和條件效應解釋量最高(33.0%)，二者與酸類含量均呈顯著負相關(P＜0.05)，烷烴類含量與濕地TOC去除率呈顯著正相關性最大.

圖 3 不同收割時間處理下蘆葦根系分泌物中的組分個數Fig.3 Component number of reed root exudates under different harvest time treatments

圖 4 不同收割時間處理下蘆葦根系分泌物的總量和各類型的相對含量Fig.4 Total and relative amount of reed root exudates under different harvest time treatments

進一步分析烷烴類和酸類中各化合物含量對2年試驗的濕地TOC和TN去除率變化的影響，結果如圖5所示，試驗第1年，3-甲基十四烷、二十烷、十四烷、2-甲基十五烷、十五烷、十八烷含量對濕地TOC和TN去除率的單獨效應解釋量分別為63.6%、59.6%、56.9%、55.0%、53.8%、31.8%，與TOC和TN去除率均呈顯著正相關(P＜0.05)；試驗第2年，硬脂酸、3-甲基十四烷、棕櫚酸含量對濕地TOC和TN去除率的單獨效應解釋量分別為40.6%、33.1%、29.0%，其中濕地TOC和TN去除率與硬脂酸和棕櫚酸含量呈顯著負相關(P＜0.05)，與3-甲基十四烷含量呈顯著正相關(P＜0.05).

圖 5 濕地TOC和TN去除率與蘆葦根系分泌物關系的RDA分析Fig.5 RDA analysis of wetland TOC and TN removal efficiency with reed root exudates

3 討論

3.1 不同收割時間對濕地有機物去除效果的影響

濕地對有機物的去除主要依賴微生物的生物降解活動來實現[13]，該研究中，進水ρ(TOC)與ρ(TN)成正比，即試驗第1年的進水ρ(TOC)和ρ(TN)均高于第2年，但兩年間的濕地TOC平均去除率差異較小(第1年為29.6%±16.3%，第2年為29.0%±22.2%)，說明雖然進水ρ(TN)對濕地的脫氮效果有一定影響[7,11]，但進水ρ(TOC)對濕地有機物的去除效果可能影響不大. 濕地對有機物的去除效果與植物生長周期和季節變化相關，研究[14]表明，低溫季節影響濕地的有機物去除效果，與該研究結果基本一致，冬季略微降低了濕地的TOC去除率，但與濕地脫氮效果相比影響較小，說明與脫氮菌相比，主要分解有機物的異養菌可能受溫度的影響相對較小[14].

不同收割時間對濕地有機物去除效果產生影響，2年試驗均表現出W1處理降低了濕地的TOC去除率，研究[15]表明，正在生長的植物會將光合產物以有機碳的形式分泌到環境中，為微生物提供碳源，產生根際效應[16]，龐大的根系也能為微生物的生長繁殖提供良好場所，通過根系泌氧為微生物提供充足的氧氣，促進其代謝活動[17]，而枯萎前地上部收割會影響植物的光合作用和根系泌氧作用，從而影響微生物生長活動的根際微環境[18]，降低了微生物對有機物的降解.筆者研究結果表明，越晚收割則越能增加濕地的TOC去除率，可能是因為不收割的蘆葦根系會持續分泌有機碳，而冬季微生物活動降低，對碳源的利用能力不足，根系分泌物釋放反而影響了濕地的有機物去除效果，這與濕地脫氮效果結果不同，即與W1處理相比，收割處理均降低了濕地的脫氮效果，但W4處理對濕地脫氮效果的影響較小[7,11]. 2年試驗均表現出W4處理后濕地TOC去除率增加的趨勢，尤其是進水ρ(TOC)較低的年份增加顯著(P＜0.05)，可能是因為W4處理后，根系本身分泌物量降低，加上氣候逐漸變暖使微生物活動逐漸增強，平衡了根系分泌物釋放量與微生物碳源利用量的關系，使有機物去除效果增加.

3.2 不同收割時間對根系分泌物組成和含量的影響

根系分泌物組成和含量變化是植物對環境變化響應的集中表現，當環境條件發生改變時，植物可以通過調節根系分泌物的釋放來適應和改善其生長環境[19]. 研究[20]表明，烷烴、醇、醛、酮等小分子化合物，具有低分子量、低沸點、高蒸汽壓、弱極性、親脂性等特點，有能夠長距離傳播、介導有機體間非直接接觸的相互作用和低濃度即可被感知等優勢，在根際微環境中起著重要作用[21]. 該研究的蘆葦根系分泌物中共檢出10類化合物，包括烷烴、酯、酮、酸、醇、硅烷、酚、醛、酰胺、噻唑等，其中烷烴類在種類數量上占比(45.7%)相對較大，與韋雪晶等[22]研究結果一致，其檢出蘆葦根系分泌物中烷烴類無論在種類數量還是相對含量上均占優勢. 已有研究[19]發現，香蒲根系分泌物組成有烷烴、烯烴、酸、苯酚、生物堿、脂、酮、醇、苯和唑等，烷烴類在種類數量和相對含量上占比亦較大. 烴類碳鏈結構穩定，較難降解，在自然界中廣泛存在[6]，是植物根際微生物的重要碳源. 該研究中，雖然烷烴類在種類數量上占優勢，但是在相對含量上可能與進水ρ(TN)有關，進水ρ(TN)較高的年份，烷烴類相對含量占比(45.9%~81.2%)最大，而進水ρ(TN)較低的年份，酸類相對含量占比(32.4%~62.6%)最大. 研究[23]表明，高氮脅迫下蘆葦根系分泌有機酸會受到抑制，這可能是試驗第1年根系分泌酸類化合物相對含量比第2年低的原因. 收割處理使根系分泌物在種類數量上有減少趨勢，不同收割時間處理下烷烴類在數量上有較明顯的變化，W2處理后烷烴類數量明顯減少，W3和W4處理后均表現出烷烴類數量增加的趨勢，這可能是植物通過調節根系分泌物的種類組成來適應收割干擾后生長狀況的變化.

盡管2年試驗的進水ρ(TN)不同，但根系分泌物總量沒有表現出年份之間的差異，與Zhao等[2]研究結果相似. 從不同收割時間對根系分泌物總量的影響來看，除第2年的第3次采樣外，收割處理均降低了蘆葦根系分泌物總量，且進水ρ(TN)較高的年份，越早收割降低地越為明顯. 收割是對植物生長的一種干擾，會影響光合產物以有機碳的形式從根部分泌，導致根系分泌物的降低，若進水ρ(TN)較高，蘆葦根系活力亦較高[6]，植物生長代謝活動更加旺盛，枯萎前收割對植物的干擾相對更大. W4處理后，雖然根系分泌物的量降低，但濕地的TOC去除率卻增加，可能與根系分泌物釋放量與微生物碳源利用量的平衡有關.

植物根部可以釋放不同類型的含碳化合物來刺激根際微生物的生長[24]，其中，烷烴類和酸類本身及其次生代謝產物具有一定的化感作用[25]. 研究[26]表明，環境因子脅迫能夠誘導植物根系次生代謝途徑發生改變，導致根系次生代謝物質成分發生變化，以抵御環境因子的脅迫，如香蒲在正常生境下，根系分泌烴類物質以正構烷烴為主，受到環境因子脅迫時，便會大量分泌支鏈烷烴和支鏈烯烴化合物. 酸類可作為有益菌在不同植物模式下的化學引誘劑[27]，從而有利于根際微生物的塑造和定殖，進而驅動植物生長和防御反饋[28]. 該研究中，2年試驗的不同收割時間處理下，烷烴類和酸類相對含量變化趨勢不同. 其中，第1年，與W1處理相比，剛收割后各處理均表現出烷烴類相對含量增加而酸類減少的趨勢；第2年，不同收割時間處理后酸類和烷烴類相對含量變化趨勢表現不同，這可能與進水ρ(TN)有關，植物生長環境中的氮濃度不同，受干擾后的表現也不同，植物通過調節根系分泌物的釋放量，來滿足自身適應環境變化的需要.

3.3 濕地污染物去除效果與根系分泌物的關系

通過RDA分析表明，濕地的TOC和TN去除率與根系分泌物含量之間密切相關，進水ρ(TN)較高的年份，烷烴類含量對濕地TOC和TN去除率的解釋量(48.8%)最高，進水ρ(TN)較低的年份，酸類含量對濕地TOC和TN去除率解釋量(33.0%)最高，說明環境中氮濃度不同，植物通過調節根系分泌物的組成和含量來適應收割干擾的策略不同，并與濕地污染物去除效果存在密切關系. 深入分析發現，進水ρ(TN)較高的年份，濕地TOC和TN去除率主要受烷烴類中3-甲基十四烷、二十烷、十四烷、2-甲基十五烷、十五烷、十八烷等含量影響，且均呈正相關. 進水ρ(TN)較低的年份，濕地TOC和TN去除率主要受酸類中硬脂酸、棕櫚酸和烷烴類中3-甲基十四烷等含量影響，且與酸類含量呈負相關，與烷烴類含量呈正相關.研究[29-30]發現，二十六烷和十四烷能促進植物生長，而棕櫚酸會抑制植物生長，這可能在一定程度上解釋了該研究中濕地污染物去除效果與烷烴類含量呈正相關而與酸類含量呈負相關的原因，根系分泌物的組成和含量促進或抑制了植物生長，從而塑造了具有不同多樣性和功能的根際微生物群落[2]，繼而會影響濕地的污染物去除效果. 研究[31]發現，微生物也會釋放豐富的以烴類為主的物質，而根系分泌物除包括根系的直接分泌產物外，還包括經微生物代謝或直接來自微生物本身的產物[32]，后續有必要更加深入研究和分離根系分泌物中的根系直接分泌產物和根際微生物本身代謝產物，并闡明其作用機制，以了解各調控機制在濕地污染物凈化過程中的重要功能.

4 結論

a) 枯萎期不同時間收割影響蘆葦濕地的有機物去除效果和根系分泌物的組成和特征. 與不收割處理相比，枯萎前收割會降低濕地的TOC去除率，枯萎末期收割會增加濕地的TOC去除率，即濕地蘆葦在枯萎末期收割對有機物的去除效果最好.

b) 蘆葦根系分泌物檢出10類35種化合物，烷烴類數量占比最高. 與不收割處理相比，收割處理后根系分泌物數量均呈降低趨勢.

c) 蘆葦根系分泌物中組分相對含量受收割時間和進水ρ(TN)的影響. 進水ρ(TN)較高的年份，根系分泌物中烷烴類相對含量最大，收割處理后均烷烴類相對含量增加而酸類減少；進水ρ(TN)較低的年份，根系分泌物中酸類相對含量最大，枯萎前收割后酸類相對含量增加，烷烴類相對含量減少后又逐漸增加，枯萎中期收割后酸類和烷烴類相對含量均增加，枯萎末期收割后酸類相對含量減少而烷烴類增加.

d) 蘆葦濕地TOC和TN去除率與根系分泌物的組成特征存在一定的相關性，進水ρ(TN)較高的年份主要受烷烴類含量的影響(呈正相關)；進水ρ(TN)較低的年份則主要受酸類含量的影響(呈負相關).