隔物灸調控缺氧誘導因子-1α表達抑制慢性萎縮性胃炎大鼠糖酵解的機制研究

李琪 吳夢蝶 劉世敏 蕭有智 王文佳 馬喆 黃艷 李靈杰 李璟 劉慧榮

摘要 目的：觀察慢性萎縮性胃炎（CAG）大鼠胃黏膜組織缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）及糖酵解關鍵酶表達變化，探究隔物灸對CAG的作用及可能機制。方法：將雄性Wistar大鼠隨機分為正常組和造模組，自由飲用170 mg/L濃度MNNG聯合法進行CAG大鼠造模。鑒定模型成功后，造模組大鼠隨機分為模型組、隔藥餅灸組、隔姜灸組和西藥組，每組6只。隔藥餅灸組、隔姜灸組均取中脘、氣海穴進行隔物灸干預，西藥組給予葉酸懸濁液灌胃。采用HE染色法觀察胃竇組織病理學變化，實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測胃黏膜組織信號轉導及轉錄激活因子3（STAT3）、丙酮酸激酶M2（PKM2）和HIF-1α的mRNA表達水平，免疫組織化學法檢測胃黏膜組織STAT3、HIF-1α蛋白表達，比色法和ELISA法測定胃黏膜組織LDH、PKM2活性。結果：與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜組織固有腺體結構紊亂，腺體減少，出現萎縮、腸化、假幽門腺化生和（或）異型增生。模型組大鼠胃黏膜組織HIF-1α、STAT3、PKM2 mRNA表達上調（P<0.05），STAT3、HIF-1α蛋白表達增加（P<0.05），LDH、PKM2酶活性增加（P<0.05）。與模型組比較，隔藥餅灸組、隔姜灸組、西藥組固有腺體排列較規整，固有腺體萎縮、腸上皮化生、異型增生程度減輕;隔藥餅灸和隔姜灸均能下調大鼠胃黏膜組織中HIF-1α、STAT3 mRNA與蛋白表達（P<0.05），降低LDH、PKM2酶活性（P<0.05）。結論：隔物灸中脘、氣海穴可改善CAG大鼠胃竇組織形態學病變，修復胃黏膜損傷。抑制HIF-1α介導的異常糖酵解代謝水平可能是隔物灸法治療CAG的效應機制之一。

關鍵詞 艾灸療法;隔藥餅灸;隔姜灸;慢性萎縮性胃炎;缺氧誘導因子-1α;糖酵解

Mechanism of Indirect Moxibustion in Inhibition of Glycolysis in Rats with Chronic Atrophic Gastritis by Regulating HIF-1α Expression

LI Qi1，WU Mengdie1，LIU Shimin2，XIAO Youzhi3，WANG Wenjia1，MA Zhe2，HUANG Yan2，LI Lingjie1，2，LI Jing1，LIU Huirong1，2

（1 Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200437，China; 2 Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian，Shanghai 200030，China; 3 Shanghai Xinqidian Rehabilitation Hospital，Shanghai 201107，China）

Abstract Objective：To observe the expression changes of HIF-1α and glycolysis enzymes in gastric mucosa of rats with chronic atrophic gastritis （CAG） and explore the mechanism of indirect moxibustion on CAG.Methods：Male Wistar rats were randomly divided into a normal group and an experimental group.The CAG model was induced in the experimental group by administration of MNNG （170 mg/L）.The model rats were then randomly divided into a model group，a herb-partitioned moxibustion （HM） group，a ginger-partitioned moxibustion （GM） group，and a western medicine （WM） group，with six rats in each group.“Zhongwan” （CV 12） and “Qihai” （CV 6） were selected for indirect moxibustion in the HM group and the GM group.The folic acid suspension was administered to the rats in the WM group by gavage.The histopathological changes of gastric antrum were observed by HE staining.The mRNA expression of STAT3，PKM2 and HIF-1α in the gastric mucosa was detected by RT-qPCR，and the protein expression of STAT3 and HIF-1α was detected by immunohistochemistry.The activities of LDH and PKM2 were determined by colorimetry and ELISA.Results：Compared with the normal group，the model group showed the structural disorder of inherent glands，reduced glands，atrophy，intestinal metaplasia，pseudopyloric metaplasia，and/or dysplasia in the gastric mucosa.Furthermore，the mRNA expression of HIF-1α，STAT3，and PKM2 in the gastric mucosa was up-regulated （P<0.05），the protein expression of STAT3 and HIF-1α was elevated （P<0.05），and the enzyme activities of LDH and PKM2 were potentiated in the model group （P<0.05）.Compared with the model group，the HM group，the GM group，and the WM group showed the regular arrangement of inherent glands，and relieved inherent gland atrophy，intestinal metaplasia，and dysplasia.Compared with the model group，the HM group and the GM group displayed down-regulated mRNA and protein expression levels of HIF-1α and STAT3 in the gastric mucosa （P<0.05），and weakened enzyme activities of LDH and PKM2 （P<0.05）.Conclusion：Indirect moxibustion at “Zhongwan” （CV 12） and “Qihai” （CV 6） can improve the histological changes of the gastric antrum and repair gastric mucosa damage in rats with CAG，and the mechanism of indirect moxibustion in the treatment of CAG may be related to the inhibition of abnormal glycolysis mediated by HIF-1α.

Keywords Moxibustion; Herb-partitioned moxibustion; Ginger-partitioned moxibustion; Chronic atrophic gastritis; Hypoxia-inducible factor-1α; Glycolysis

中圖分類號：R245.82文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.03.006

慢性萎縮性胃炎（Chronic Atrophic Gastritis，CAG）以胃脹滿不適、食欲不振、惡心泛酸、嘔吐、乏力、噯氣等臨床表現為特征，隨病情發展可影響患者心理健康并導致抑郁和焦慮。胃黏膜病理活檢是CAG的主要診斷方法，鏡下病理改變可見胃黏膜上皮腺體萎縮，固有腺體減少或消失，胃黏膜變薄，或伴腸上皮化生及異型增生等[1]。CAG與胃癌的發生發展密切相關，許多患者的最終結局即為胃癌，因此世界衛生組織專家于1978年將其列為胃癌的癌前疾病[2]。是故早期診斷并盡早地介入治療以阻斷CAG進一步惡化發展，對于預防胃癌發生具有重要的臨床價值。

CAG的發病機制十分復雜，與炎癥及相關組織異常代謝關系密切。炎癥是一種保護性反應，可抵御感染或損傷，修復機體組織[3]，但在某些情況下，免疫細胞無法從炎癥狀態轉變為抗炎狀態，且炎癥會隨時間流逝而持續存在，并轉變為慢性炎癥。近年來研究表明，細胞異常代謝對炎癥促進或抑制狀態的調控至關重要，細胞異常代謝及能量供應成為研究難點之一[4]。其中糖酵解代謝異常參與胃癌的發生與發展，無論在正常氧分壓還是缺氧狀態下，胃癌細胞均能優先進行有氧糖酵解方式進行糖代謝，這一現象也稱為瓦爾堡效應[5]。CAG伴隨的胃黏膜腺體萎縮作為胃癌前病變的起始階段，經腸上皮化生和異型增生等持續進展的病理改變，最終形成胃癌。在由CAG向胃癌進展的過程中同時伴隨有糖酵解水平異常變化[6]，在此過程中糖酵解通量的增加需要編碼葡萄糖轉運蛋白和糖酵解酶的基因的轉錄激活，這些相關酶的基因主要由缺氧誘導因子-1α（Hypoxia-inducible Factor-1α，HIF-1α）介導，它是糖酵解上游的關鍵調控分子[7]，參與有氧糖酵解中關鍵酶的調節。

目前臨床上主要采用對癥藥物治療CAG等癌前病變，但仍沒有特效的治療方案，整體療效有待提高。艾灸療法歷經千年歷史，在治療胃病方面具有獨特優勢，可改善CAG患者臨床癥狀[8-9]，但其潛在作用機制還有待深入探索。本研究擬從隔藥灸調控HIF-1α及糖酵解代謝角度探究艾灸治療CAG的作用機制，為臨床艾灸治療CAG提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 44只6周齡清潔級Wistar大鼠（雄性），體質量為（150±30）g，實驗動物由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。動物合格證編號為2015000538649;許可證號為SCXK（滬）2012-0002。飼養環境設置為室溫18～22 ℃，室內濕度40%～70%，保持12 h晝夜節律。實驗過程嚴格按照上海中醫藥大學實驗動物管理委員會制定的實驗動物使用及保護條例操作，并通過動物福利倫理委員會批準（倫理審批號：17743）。

1.1.2 藥物 N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）（東京化成工業株式會社，日本，批號：TCI-M0527）;葉酸片（常州制藥廠有限公司，國藥準字H32023302）。

1.1.3 試劑與儀器 多聚甲醛（上海國藥集團，批號：80096618）;蘇木精-伊紅染液（南京建成，批號：D006-1-1）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（司鼎生物，批號：SD0012）;大鼠乳酸脫氫酶檢測試劑盒、腫瘤型M2-PK（M2-PK）ELISA試劑盒（司鼎生物，批號：SDR0067、SDR0068）;RT reagent Kit（TAKARA，日本，批號：RR047A）;TB Green qPCR試劑盒（TAKARA，日本，批號：RR420A）;Trizol（Invitrogen，美國，批號：15596018）;Anti-STAT3抗體（Abcam，英國，批號：ab76315）;Anti-HIF-1 alpha抗體（Abcam，英國，批號：ab216842）。脫水機（Leica，德國，型號：ASP200）、包埋機（Leica，德國，型號：EG1160）、切片機（Leica，德國，型號：RM2235）、展片機（Leica，德國，型號：HI1210）;分光光度計（Thermo公司，美國，型號：NanoDrop 2000）;PCR儀（Applied Biosystems，美國，型號：Veriti 96-Well Thermal Cycler）;qPCR儀（Roche，美國，型號：LightCycler 480Ⅱ）;光學顯微鏡（Olympus公司，日本，型號：BX53）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 實驗大鼠44只，預適應1周后，隨機分為正常組（n=8）和造模組（n=36）。正常組大鼠予以常規飲食。造模組大鼠采用170 mg/L MNNG結合夾尾與饑飽失常綜合刺激法制備CAG大鼠模型[10]。每日新鮮配制MNNG溶液自由飲用;飽食2 d，禁食1 d，循環實施;使用夾尾鉗夾鼠尾夾緊10 min/次，1次/周，使之保持激怒和互相攻擊的狀態;造模34周后隨機抓取正常組2只、造模組大鼠4只進行模型鑒定，取胃竇組織胃黏膜做HE染色病理觀察。鏡下見胃黏膜出現腺體萎縮、和（或）腸上皮化生、異型增生等病理變化，確定模型制作成功。造模期間造模組大鼠共計死亡8只，模型鑒定后將24只造模組大鼠按體質量分級分為4組：模型組、隔藥餅灸組、隔姜灸組和西藥組，每組6只。

1.2.2 干預方法 正常組與模型組大鼠不進行干預，只做與3組干預組相同的抓握和固定操作;隔藥餅灸組、隔姜灸組CAG大鼠干預均取中脘穴、氣海穴進行隔物灸[11]，使用鼠衣及塑料大鼠固定架約束大鼠，將規格為直徑1 cm、厚度0.5 cm的藥餅（主要成分為制附子、肉桂等，用黃酒調制而成）或生姜切片置于大鼠的穴區上，上置艾炷90 mg，每穴灸2壯，1次/d，6次/周，共4周;西藥組按照1 mL/100 g給予葉酸懸濁液灌胃，1次/d，6次/周，共4周。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 大鼠胃竇的組織病理學觀察 大鼠禁食不禁水24 h后稱重取材：采用2%戊巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉，麻醉后將大鼠腹部朝上固定，剖開腹腔，快速將全胃取出，于冰上將全胃沿胃大彎剪開，洗凈胃內容物后切取病變黏膜組織;取1/2胃竇部組織剪碎后存于凍存管內，后迅速投入液氮冷凍1 h，及時轉移至-80 ℃冰箱凍存備用;其余胃竇部組織固定于4%多聚甲醛48 h，脫水后石蠟包埋、切片（厚4 μm），進行蘇木精-伊紅染色，于200倍光鏡下觀察拍片。

1.2.3.2 采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測胃黏膜HIF-1α、信號轉導及轉錄激活因子3（Signal Transduction and Activator of Transcription3，STAT3）、丙酮酸激酶M（PKM）的mRNA表達 取樣各組大鼠胃黏膜組織100 mg進行預處理→加入氯仿→12 000 r/min離心15 min（離心半徑9.5 cm）后取上清液→加入異丙醇混勻后沉淀→離心得到微量白色沉淀→4 ℃環境下反復離心→提取總RNA→反轉錄→配制反應液（冰上）→實施Real Time檢測→數據分析。引物序列見表1。

1.2.3.3 采用免疫組織化學法檢測STAT3、HIF-1α蛋白在胃黏膜中的定位和表達 石蠟切片（厚4 μm）→二甲苯脫蠟至水→檸檬酸鹽水抗原修復→過氧化物酶阻斷→BSA封閉→分別滴加一抗、二抗→PBS洗滌→加入DBS顯色→蘇木精復染3 min→脫水封片，拍照觀察，統計每張圖像的積分光密度（IOD）和陽性表達面積（Area），計算平均光密度值（AOD）。

1.2.3.4 胃黏膜組織丙酮酸激酶M2（PKM2）和乳酸脫氫酶（LDH）活性測定 采用ELISA法檢測PKM2活性。完成樣本收集與溶液配置后開始檢測：加樣→洗板→加入酶標抗體工作液→重復操作→加入底物工作液→在37 ℃烘箱中反應15 min（避光）→加入終止液并充分混勻并測量450 nm吸光度→計算濃度。LDH活性采用比色法在酶標板上反應，樣品及標準品中的LDH與底物工作液顯色，測量490 nm處OD值，并通過繪制標準曲線求出相應的LDH濃度。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析。符合正態的測量數據采用均數±標準差（±s）表示，非正態的數據采用M（P25，P75）表示。符合正態的數據采用單因素方差分析。若方差齊性，則使用最小顯著差異法LSD進行兩兩比較;方差不齊性則采用Dunnett′s T3檢驗。如果數據不符合正態性則使用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠胃黏膜組織病理學觀察

由圖1可見，正常組大鼠胃黏膜固有腺體結構正常、排列規整，未見腺體萎縮及胃主細胞、壁細胞減少，可見少量中性粒細胞、淋巴細胞;模型組大鼠固有腺體結構紊亂，腺體減少，成纖維細胞增殖，可見諸如腺體萎縮、腸上皮化生、假幽門腺化生和（或）異型增生等病理改變。經干預后，隔藥餅灸組、隔姜灸組、西藥組大鼠黏膜層及下層炎癥細胞相較模型組少，胃黏膜腺體萎縮、腸化生、異型增生等病理變化程度減輕。

2.2 隔物灸對CAG大鼠胃黏膜組織STAT3、HIF-1α、PKM2 mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組CAG大鼠胃黏膜組織中STAT3、HIF-1α、PKM2 mRNA表達水平上調，差異均有統計學意義（均P<0.05）。與模型組比較，隔藥餅灸組、隔姜灸組、西藥組大鼠胃黏膜組織中STAT3、HIF-1α mRNA表達下調，差異有統計學意義（均P<0.05）。與模型組比較，3組干預組大鼠PKM2 mRNA表達差異無統計學意義（P>0.05）。見表2～3。

2.3 隔物灸對CAG大鼠胃黏膜組織STAT3、HIF-1α蛋白定位及表達的影響

正常組大鼠胃黏膜組織STAT3、HIF-1α蛋白有少量表達，主要表達在胞漿，著色較淺;模型組胃黏膜組織STAT3、HIF-1α蛋白陽性表達增多，胃黏膜固有腺體呈大面積胞漿黃染，分布密集，著色較深;與模型組比較，2組隔物灸組及西藥組大鼠胃黏膜組織STAT3、HIF-1α陽性表達減少，胞漿染色變淺。與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜STAT3、HIF-1α平均光密度顯著升高（均P<0.01）;與模型組比較，2組隔物灸組、西藥組大鼠胃黏膜組織STAT3、HIF-1α平均光密度降低，差異均有統計學意義（均P<0.05）。見表4、圖2～3。

2.4 隔物灸對CAG大鼠胃黏膜組織LDH、PKM2濃度的影響

模型組大鼠與正常組大鼠比較，LDH和PKM2濃度顯著升高（均P<0.01）;與模型組比較，兩隔物灸組大鼠胃黏膜中PKM2濃度下降，差異均有統計學意義（均P<0.05），兩隔物灸組與西藥組大鼠胃黏膜LDH濃度顯著下降（均P<0.01）。見表5、圖4。

3 討論

據統計，CAG患病率在不同國家和地區具有較大差異，主要致病原因與幽門螺桿菌感染、環境、遺傳、早期診斷等因素有關。我國屬于CAG高發地區，據中華醫學會2011年間開展的一項橫斷面調查結果顯示[12]，納入的8 892例慢性胃炎患者中有1 573位被診斷為CAG，其中腸上皮化生和異型增生分別占23.6%和7.3%，在慢性胃炎患者病理檢查中較為常見。此外，無論是男性或女性，CAG發病率及檢出率均隨年齡增長而顯著上升，其患病率與胃癌發病率正相關。

CAG主要屬中醫胃痞、胃脘痛、呃逆等范疇，主證為胃脘部脹滿、痞悶不舒。病因則不外乎飲食不節、外感六淫、情志不暢、脾胃虛弱等方面。本研究隔物灸所選取中脘、氣海兩穴為臨床胃病治療之要穴。中脘穴別名太倉、胃脘，為胃之募穴，又為腑會，與胃腑之氣相通;氣海穴為肓之原穴，亦為足三陰交與任脈之交會穴，主一身上下氣機。兩穴均屬任脈，臨床主要用于胃痛、腹脹、食不化等癥狀。隔物灸屬傳統灸法間接灸范圍，可根據所隔介質之不同有針對性地加強療效。本研究所選隔藥餅灸與隔姜灸2者在臨床胃病治療中均廣為運用，所用藥餅主要成分為附子、肉桂，具有溫陽助火之效，隔姜灸則取生姜辛溫之性，灸之可溫補中土、散寒止嘔。本團隊前期通過臨床及動物實驗兩方面明確了艾灸對CAG的有效性，可有效緩解CAG患者消化不良等癥狀，促進胃黏膜上皮的修復[13]，逆轉腸化，從而預防癌變的發生[14]。

CAG發病機制十分復雜，糖酵解代謝異常參與胃癌的發生與發展[6]，其在癌前病變中的重要性也逐漸得到重視。Liu等[15]研究證實，在胃癌前病變中既已存在糖酵解水平的異常。胃黏膜組織的局部缺氧可導致CAG大鼠胃黏膜血管內皮細胞損傷，HIF-1α在缺氧刺激下活性增加，刺激局部微血管新生，并在炎癥反應、腫瘤浸潤生長及各種基因的轉錄等方面起重要作用[16-17]。同時，HIF-1α是糖酵解的關鍵上游調節因子，HIF-1α的過表達可通過上調糖酵解酶的表達來促進糖酵解活性，改變細胞糖酵解水平[18-20]。STAT3可調節HIF-1α的穩定性和活性，激活的STAT3可通過阻斷HIF-1α的降解，加速其從頭合成，從而增加HIF-1α穩定性，上調HIF-1α蛋白水平[21]。PKM2和LDH是糖酵解代謝中的重要調節酶。前者是催化磷酸烯醇式丙酮酸轉化為丙酮酸的限速酶，為糖酵解途徑的最后環節[22]。此外，PKM2可通過磷酸化STAT3來激活HIF-1α的轉錄[23]，當它易位到細胞核時，與HIF-1α發生相互作用從而調節諸多糖酵解酶的表達。同時研究還發現，過表達PKM2在癌細胞中伴有著更高的葡萄糖消耗與乳酸水平[24]。LDH則可使丙酮酸生產乳酸，當乳酸過度堆積時使微環境酸化，有利于腫瘤的發生發展[25]。

本實驗結果顯示，CAG大鼠胃黏膜組織中STAT3、HIF-1α mRNA表達上調，STAT3、HIF-1α蛋白表達顯著升高，提示慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜存在缺氧情況。研究結果還發現，模型組大鼠胃黏膜組織中PKM2 mRNA表達上調，PKM2、LDH活性顯著升高，提示CAG大鼠糖酵解水平異常升高。經隔物灸干預后，2組隔物灸組CAG大鼠STAT3、HIF-1α mRNA及蛋白表達均下調，糖酵解調節酶PKM2、LDH活性下降，而隔物灸對PKM2 mRNA的表達影響僅有下調趨勢。以上結果提示，隔物灸可通過下調糖酵解上游調節因子HIF-1α及其調控因子STAT3的表達，降低糖酵解調節酶PKM2、LDH活性，抑制CAG大鼠胃黏膜組織的有氧糖酵解，起到改善胃黏膜組織異常糖代謝的作用，以阻斷萎縮性胃炎惡化，進一步趨向癌癥的發展。

本研究從隔物灸對CAG大鼠HIF-1α表達及相關糖酵解調節酶的影響進行闡述和分析，從新的角度闡釋艾灸對CAG的效應機制，研究發現抑制HIF-1α介導的異常糖酵解代謝水平可能是隔物灸法治療CAG的效應機制之一。然而本實驗僅檢測了2個糖酵解調節關鍵酶，且2種隔物灸灸法之間的差異未進行深入挖掘，后續研究中將進一步開展相關檢測，擬更全面闡述艾灸對糖酵解代謝的影響。其次，關于CAG大鼠胃黏膜組織有氧糖酵解的啟動機制仍不明確，對艾灸調控HIF-1α的機制與相關通路并未做深入探索，未來將結合基因敲除動物進行深入的研究。

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（2022-01-06收稿 本文編輯：吳珊）