β-葡聚糖酶對高燕麥含量面團性質與蛋白結構的影響

錢海峰，潘琪鋒，李 言，王 立，樊銘聰

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

燕麥中膳食纖維的主要成分是 β-葡聚糖[1]，含量約為2%～8%。在過去幾十年中，因其出色的功能特性和營養特性而受到了廣泛關注，研究表明，它可以通過調節腸道菌群而發揮其有益作用[2]。β-葡聚糖對益生菌如雙歧桿菌和乳桿菌的生長促進作用已通過體內和體外研究證明，它是菌群發酵的良好底物，促進了短鏈脂肪酸的生成[1]，具有維持或降低膽固醇和脂質水平[3]、預防動脈粥樣硬化、抗消化、調節血糖[2]、改善胃腸功能、免疫調節、抗腫瘤作用以及預防Ⅱ型糖尿病和心血管疾病的作用[4]。燕麥富含蛋白質、礦物質、脂類、β-葡聚糖和其它營養因子，它在制備功能性食品方面具有廣闊的應用前景，Fras等[5]在小黑麥粉中添加5%的高膳食纖維濃縮燕麥粉，豐富并優化了面包中氨基酸的組成，尤其是賴氨酸的增加，提高了人體對蛋白質的利用效率，同時增加了膳食纖維和不飽和脂肪酸，使面包的營養價值得到提升。

因為燕麥含有少量或不含面筋蛋白，因此，用燕麥粉制得的面團通常表現出高彈性模量和粘性模量[6]。而適合于焙烤制作的面團必須能夠響應氣體膨脹而伸展，為了獲得具有良好結構和體積的產品，面團強度必須足以防止塌陷，同時還能夠伸展而不會過早斷裂[7]。面團的延展性主要受到面團中蛋白質和淀粉網絡以及分子鏈段間或分子內相互作用力的影響。增加燕麥粉在小麥面粉中的含量，會導致面團具有較高彈性模量、粘性模量和屈服應力并且會降低混粉的峰值黏度、糊化溫度、凝膠硬度、溶脹體積和稠度系數[8]。而較小的粘性和彈性模量，對面包體積的發展是有利的[9]。燕麥粉面團的流變學特性與 β-葡聚糖的含量和分子量有直接的關系，β-葡聚糖含量的增加會使面團表觀黏度上升，導致面團延展性降低，硬度增大，無法直接應用于焙烤食品[10]。

膳食纖維與麩質的相互作用是一個復雜的現象，這些相互作用與蛋白質二級和三級結構，二硫鍵和氫鍵結合模式的改變有關[11]。目前的結果一致認為，大多數可溶性纖維通過氫鍵和疏水性相互作用與面筋發生非共價相互作用。在存在不溶性多糖纖維的情況下，相互作用由纖維的溶脹和水合程度決定，它在與面筋蛋白競爭性吸水和物理位阻效應中起著重要的作用[12]。面筋蛋白與膳食纖維之間競爭性的結合水，會導致面筋蛋白的構象變化以及面筋蛋白聚集體網絡結構位置的塌陷[13]。同時膳食纖維對面筋蛋白的稀釋作用，會在物理上破壞面筋網絡[14]。因此，在開發含有高燕麥粉含量面包時，高含量的β-葡聚糖會導致面包體積顯著減少和面包芯硬度增加。原因可能是因為高水平的β-葡聚糖與面筋競爭水分，從而阻礙了面團中面筋網絡的正常發展，物理上稀釋了面筋，并改變了面筋網絡的連續性，面筋網絡薄弱，從而導致發酵過程中氣室的早期破裂以及面團的低膨脹。

本文旨在探究β-葡聚糖酶對燕麥面包預拌粉面團加工特性以及面筋蛋白理化特性及面筋形成變化規律的影響，探討β-葡聚糖酶在高燕麥粉含量面團中的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

裸燕麥（蛋白質 11.9%、脂肪 6.2%、淀粉58.0%、膳食纖維11.92%）：黑龍江五常市彩橋米業有限公司；β-葡聚糖酶（酶活20 000 U/g，粉狀）：廣西龐博生物工程有限公司；谷朊粉（蛋白質82.5%、脂肪 0.7%、淀粉 6.8%）：安徽安特食品股份有限公司；高筋小麥粉（蛋白質 12.8%、脂肪 1.6%、淀粉 72.0%）：東莞益海嘉里糧油食品工業有限公司；鹽：市售；黃油：新西蘭恒天然集團；高糖酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HC-800Y型高速多功能粉碎機：武漢海納電器有限公司；WTN-25型和面機：無錫聯合緯創機械有限公司；Nicolet IS10型傅立葉紅外光譜儀：美國賽默飛世爾科技公司；F-7000型熒光光譜儀、CR-21GIII型高速離心機：日本日立公司；HZ-9212SB型水浴振蕩器：太倉市華利達實驗設備有限公司；L550型離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；DHR-3型動態流變儀：美國沃特世公司；T9型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；ChemiDoc XRS+型化學發光凝膠成像系統：美國伯樂公司；DAWN HELEOS Ⅱ型多角度激光光散射凝膠色譜系統檢測：美國懷雅特技術公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 燕麥面團制作

將裸燕麥籽粒經粉碎機粉碎后，通過80目篩制得燕麥粉，通過率在95%以上。燕麥面包預拌粉由50%的燕麥粉、37.5%的小麥粉和12.5%的谷朊粉組成，燕麥面包配方包括以500 g谷物粉為基礎的燕麥面包預拌粉（含50%的燕麥粉、37.5%的小麥粉和 12.5%的谷朊粉組成的谷物粉，以及基于谷物粉質量8.0%的蔗糖，1.6%的食用鹽和不同用量的 β-葡聚糖酶）、1.5%的干酵母、8.0%的黃油和最佳的水量（由燕麥面團在粉質儀測試中最大稠度在(500±20) FU時加水數據獲得），干酵母和黃油的添加比例都基于谷物粉質量。將燕麥面包預拌粉和干酵母倒入和面機中，在低速檔位下，緩慢加入20 ℃的水后連續攪拌3 min，然后在高速檔位下攪拌2 min至面團基本成型，然后加入黃油并在低速檔位下揉至面筋完全發展，得到燕麥面團，生面團在(25±1) ℃延展30 min后進行相關面團性質測試，并將其進行冷凍干燥后獲得凍干粉進行蛋白質和葡聚糖相關分析測試。

1.3.2 面包粉粉質特性的測定

面包粉粉質特性的測定參照 GB/T 14614—2019《糧油檢驗小麥粉面團流變學特性測試粉質儀法》。稱取質量相當于300 g水分含量為14%的混合粉，25 s內加入定量水在粉質儀混揉，使面團的稠度達到(500±20) FU，記錄吸水率（%）、面團形成時間（min）、穩定性（min）、弱化度（BU）。

1.3.3 燕麥面團動態流變學特性的測定

燕麥面團動態流變學特性通過使用配備有直徑40 mm平板的DHR-3動態流變儀測定得到。測定模式為振蕩模式，夾縫間距為2 mm，壓力松弛時間為 5 min，溫度為25 ℃，應力為0.1%，掃描頻率范圍為0.1～100 Hz，試參數包括彈性模量（G′），粘性模量（G″）和損耗角 tan（G′/G″）。1.3.4 β-葡聚糖含量和分子量的測定

燕麥面團和面包中的 β-葡聚糖含量測定參照NY/T 2006—2011《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的測定》。利用地衣聚糖酶專一性地水解β-葡聚糖成寡糖，再用β-葡聚糖苷酶將寡糖水解成葡萄糖，葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下生成葡萄糖酸和過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶作用下，與 4-氨基安替比林氧化縮合生成紅色醌類化合物，此化合物在510 nm處的吸光度值與葡萄糖含量成正比。

燕麥面團中 β-葡聚糖的平均分子量測定參照Suortti的方法[15]，將2 g凍干粉分散在12 mL含0.1% NaBH4的0.1 mol/L NaOH溶液中，攪拌10 h，離心收集上清液，用淀粉酶去淀粉，并用等電點法除去蛋白，離心收集上清液，加入95%乙醇沉淀，離心收集沉淀，凍干后得到β-葡聚糖粗提物，使用多角度激光光散射凝膠色譜系統檢測分子量。

1.3.5 蛋白質游離巰基的測定

將10 mg的粉末樣品分散在4.0 mL緩沖液[2.0%十二烷基硫酸鈉（SDS），3.0 μmol/L尿素和1.0 μmol/L乙二胺四乙酸四鈉和0.05 μmol/L磷酸鈉，pH 6.5]中。將懸浮液充分振搖后，添加50 μL的 0.1%（w/v緩沖液）5, 5′-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）試劑，將該混合物在黑暗中反應30 min，然后以8 000 g離心10 min，并在412 nm處測量上清液的吸光度。空白樣品是50 μLDTNB和4.0 mL緩沖液的混合物。

計算公式如下：

式中：

73.53——DTNB的摩爾吸光系數

A412——樣品在412 nm處吸光度

D——樣品稀釋倍數

C——樣品濃度（mg/mL）

1.3.6 SDS可萃取蛋白的測定

將 150 mg粉末狀樣品分散在20 mL的 2%（w/v）十二烷基硫酸鈉（SDS）中。將懸浮液通過磁力攪拌器混合5 h，并以8 000 g離心20 min。通過使用縮二脲試劑確定上清液的蛋白質含量。

1.3.7 蛋白質二級結構的測定

使用 Nicolet IS10型傅立葉紅外光譜儀測定蛋白質的二級結構。紅外光譜采集范圍是400～4 000 cm-1，以空氣背景下，在4 cm-1的分辨率下掃描32次獲得樣品的二級結構光譜圖。通過使用OMNIC v8.0和PeakFit v4.12分析酰胺I區（1 600～1 700 cm-1）的光譜信息。

1.3.8 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考Zhou的方法[16]，采用5%濃縮膠和10%分離膠配制凝膠，將100 mg的樣品分散在20 mL 1.5% SDS溶液中。以10 000 g離心15 min，將上清液和還原型上樣緩沖液以4∶1的體積比混合，并在100 ℃下加熱10 min，取15 μL上樣，運行電壓為100 V。凝膠用0.1%的考馬斯亮藍R-250染色，并用10%的甲醇和10%的乙酸溶液脫色。非還原型SDS-PAGE的實驗方法同上，但是上樣緩沖液為非還原型。

1.3.9 蛋白質表面疏水性的測定

將約100 mg粉末狀樣品分散在20 mL 50 mmol/L的乙酸溶液中。磁力攪拌2 h，并以10 000 g離心20 min。將上清液稀釋至五種不同濃度，并與20 μL 8 mmol/L ANS（8-苯胺-1-萘磺酸）試劑在黑暗中反應15 min，通過F-7000熒光光譜儀，在390 nm的激發波長，470 nm的發射波長和5 nm的狹縫寬度下測量熒光強度。

1.4 數據分析

所有實驗至少進行三次，用 SPSS 20.0和EXCEL 2011對數據進行統計和分析，運用方差分析法（ANOVA）對數據進行顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 燕麥面包預拌粉粉質特性

表1顯示了不同β-葡聚糖酶含量對燕麥面團的粉質特性的影響。通過添加β-葡聚糖酶，燕麥面團的吸水率和形成時間顯著降低。燕麥β-葡聚糖的黏度與分子量和濃度有關。分子量和濃度越低，燕麥β-葡聚糖的黏度越低，持水能力越弱。由于β-葡聚糖酶的影響，燕麥面團中的β-葡聚糖含量和聚合度降低，導致混合粉在面團形成過程中對在水的吸收能力降低，吸水率降低。同時，由于β-葡聚糖持水能力減弱，面團中水分子的流動性可能會增強，蛋白質的水合速率會加快，面團形成時間降低。此外，β-葡聚糖酶的添加量從3 U/g增加到9 U/g對面團吸水率和形成時間幾乎沒有影響。這可能與β-葡聚糖酶的酶促水解特性有關。β-葡聚糖酶可以快速水解高分子量大麥 β-葡聚糖，而當底物是低分子量 β-葡聚糖時，β-葡聚糖酶的水解能力受到限制。

表1 不同β-葡聚糖酶含量燕麥面包預拌粉的粉質特性Table 1 The farinographic properties of pre-mixed oat bread flour with different β-glucanase content

隨著 β-葡聚糖酶添加量的增加，面團的穩定性和弱化度也顯著降低。面團穩定性表明的是面團的強度和抵抗連續混合的能力[17]。據報道，由于多糖親水膠體的高黏度和多糖鏈之間的自締合[18]，因此添加多糖親水膠體可以提高面團穩定性。因此，可以推測，由于β-葡聚糖被β-葡聚糖酶水解后黏度降低可能會降低面團抵抗連續混合的穩定性。面團弱化度的值降低表明添加了β-葡聚糖酶后，燕麥面團的面筋網絡強度提高。該結果可以推測為是大分子β-葡聚糖經β-葡聚糖酶作用后對面筋網絡的物理剪切破壞能力減弱的結果，這有助于提高燕麥面團后續的醒發高度，以及燕麥面包的比容。

2.2 面團動態流變學特性

圖1顯示了β-葡聚糖酶含量對燕麥面團動態流變性能的影響。掃描頻率從0.1 Hz增加到100 Hz，所有燕麥面團樣品的彈性模量（G′）和粘性模量（G″）都隨著頻率增大而增大。在給定的頻率下，G′值始終高于G″值，tan δ小于1。在低頻模式下，tan δ隨著頻率的升高而減小，而在高頻模型下，tan δ隨著頻率的升高而增大。該現象表明所有燕麥面團樣品表現的更像固體[30]。

圖1 不同β-葡聚糖酶含量燕麥面團的動態流變學特性Fig.1 The dynamic rheological properties of oat dough with different β-glucanase content

彈性模量反映了面團系統的剛度和強度。降低的G′值表明面團對抵抗變形的能力減弱。粘性模量反映了面團的黏度和流動性。減小的G″值表明面團的流動性增加。在給定的頻率下，燕麥面團樣品的 G′和 G″隨著 β-葡聚糖酶含量的增加而明顯降低。據報道，高黏度的β-葡聚糖分子與淀粉顆粒之間對游離水的競爭限制了淀粉顆粒的溶脹，從而導致了較大的 G′和 G″值[19]。因此，添加β-葡聚糖酶減弱了β-葡聚糖的成膠性并改善了面團的可變形性和流動性。tan δ值反映了面團的粘性和彈性成分之間的競爭關系，各燕麥面團樣品之間沒有顯著差異。

2.3 燕麥面團中β-葡聚糖含量和平均相對分子量

表2顯示了添加不同含量的β-葡聚糖酶對燕麥面團中β-葡聚糖的含量和平均相對分子量的影響。分別添加3、6和9 U/g β-葡聚糖酶來處理燕麥面團中β-葡聚糖。β-葡聚糖被β-葡聚糖酶水解后，面團的 β-葡聚糖含量分別降低了 0.14、0.27和0.78 g/100 g DW，燕麥面團中β-葡聚糖的平均相對分子量從350 KDa降至62 kDa。多糖的性質通常與其分子量密切相關。β-葡聚糖黏度和平均分子量的降低導致其在燕麥面團中的黏度、持水能力和成膠性能降低[20]，這會影響燕麥面團的流變學特性性，面筋網絡結構的形成以及最終燕麥面包的品質。

表2 燕麥面團中β-葡聚糖的含量和平均相對分子量Table 2 The contet and average molecular weight of β-glucan of oat dough

2.4 蛋白質游離巰基和SDS可萃取蛋白含量

圖2（A）顯示了β-葡聚糖酶含量對燕麥面團樣品中游離巰基含量的影響。加入β-葡聚糖酶后，面團中游離巰基含量顯著增加。該現象與在全麥面團系統中，通過添加戊聚糖酶來消除水不溶性阿拉伯木聚糖對面筋蛋白結構不利影響的結果一致[22]。隨著阿拉伯木聚糖平均分子量的減小，木聚糖與蛋白質分子之間的非共價相互作用增強，這阻止了麥谷蛋白中蛋白質間二硫鍵的形成[21]。因此，該實驗的結果也可以推測是面筋蛋白與經β-葡聚糖酶作用產生的小分子 β-葡聚糖寡糖之間非共價相互作用的結果，同時，隨著小分子β-葡聚糖寡糖的增多，其阻礙巰基間相互接觸的作用位點變多。通常，游離巰基的增加代表了蛋白中二硫鍵的減少，說明蛋白分子間的共價交作用聯減弱。

圖2 不同β-葡聚糖酶含量燕麥面團游離巰基和SDS可萃取蛋白含量Fig.2 The free sulfhydryl content and proteins extractability in SDS solution of oat dough with different β-glucanase content

圖2（B）顯示了β-葡聚糖酶含量對燕麥面團樣品在SDS溶液中可萃取蛋白含量的影響。通過添加β-葡聚糖酶，燕麥面團在SDS溶液中可萃取蛋白含量顯著上升，表明面團中的蛋白質結構發生了變化。該結果與戊聚糖酶處理全麥面團系統的結果一致，與水不溶性阿拉伯木聚糖的空間位阻效應減弱，蛋白分子之間相互作用加強有關。此外，據報道，瓜爾豆膠和魔芋葡甘露聚糖等線性非離子型親水膠體存在大量羥基，可通過氫鍵與面筋蛋白反應，這在與面筋蛋白的相互作用中起關鍵作用[23]。因此，由實驗結果可推測，高分子量β-葡聚糖被β-葡聚糖酶降解后，其對蛋白質分子之間空間位阻效應減弱，而生成的低分子量β-葡聚糖可以進入蛋白質聚集體并通過氫鍵作用提高了蛋白質分子的水合程度，蛋白質聚集體的結構得以擴展，更多的蛋白質能溶解在 SDS溶液中。

2.5 蛋白質二級結構

表3顯示了β-葡聚糖酶含量對燕麥面團樣品中蛋白質二級結構的影響。結果表明，添加β-葡聚糖酶處理后，二級結構中的β-折疊含量顯著增加，而無規則卷曲和 β-轉角的含量顯著降低。β-折疊是蛋白質二級結構中最穩定的構象。β-折疊含量的增加表明蛋白質結構變得更加有序，蛋白質分子之間的聚合程度增加，面筋網絡結果變得更加堅固，且更具有彈性[24]。

表3 不同β-葡聚糖酶含量燕麥面團蛋白二級結構Table 3 The secondary structure of proteins of oat dough with different β-glucanase content

有研究中表明，面筋蛋白分子之間的氫鍵在β-折疊結構中起著重要作用[25]。而高分子量β-葡聚糖會對面筋蛋白的二級結構產生不利影響，這是因為高分子量β-葡聚糖能夠吸收水分并形成高粘性凝膠附著在面筋表面時，會阻礙面筋網絡結構的形成。因此，β-葡聚糖在 β-葡聚糖酶作用下持水能力和成膠性減弱，面筋蛋白周圍的自由水含量增加并促進了蛋白質分子的聚集，從而增加了 β-折疊的含量[26]。

2.6 SDS-PAGE凝膠電泳

β-葡聚糖酶含量對燕麥面團樣品的 SDS-PAGE蛋白圖譜的影響如圖3所示。從圖3（A）顯示了β-葡聚糖酶含量從0增加至9 U/g時，對燕麥面團樣品的還原型SDS-PAGE蛋白圖譜的影響。未還原型SDS-PAGE蛋白圖譜的結果來看，蛋白條帶的數量或位置沒有變化。這表明添加β-葡聚糖酶不能加強蛋白質分子之間的共價交聯作用。但是，添加 β-葡聚糖酶后，A1部分的條帶強度顯著降低。該部分蛋白主要由α, β-麥醇溶蛋白組成，麥醇溶蛋白不能通過二硫鍵與其他蛋白質聚合[27]。這表明 A1部分的蛋白質分子可能與其他大分子量蛋白質糾纏在一起，并被截留在上層的濃縮膠中。

圖3 不同β-葡聚糖酶含量燕麥面團的蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.3 The SDS-PAGE pattern of protein in oat dough with different β-glucanase content

圖3（B）顯示了β-葡聚糖酶含量從0增加至9 U/g時，對燕麥面團樣品的還原型 SDS-PAGE蛋白圖譜的影響。相比于0 U/g和3 U/g的條帶，6 U/g和9 U/g的條帶在B1、B2和B3部分的條帶強度顯著增加。B1和 B2部分蛋白主要由 β-麥醇溶蛋白組成。B3部分蛋白主要由γ-麥醇溶蛋白和LMW-GS組成。因此，可以推測，在用β-葡聚糖酶處理燕麥面團可以促進面筋蛋白分子以非共價相互作用的方式聚集。

2.7 蛋白質表面疏水性

β-葡聚糖酶含量對燕麥面團樣品表面疏水性的影響如圖4所示。當添加β-葡聚糖酶時，面筋蛋白的表面疏水性降低。這可能是高分子量β-葡聚糖經β-葡聚糖酶作用產生的可溶性β-葡聚糖寡糖與面筋蛋白分子中的疏水位點直接結合并屏蔽所致[28]。此外，據研究表明面筋蛋白的表面疏水性降低還可能是蛋白質分子之間通過疏水相互作用形成蛋白質-蛋白質復合物的結果[29]。總之，用β-葡聚糖酶處理燕麥面團促進了蛋白質分子之間的聚集。

圖4 不同β-葡聚糖酶含量燕麥面團中蛋白的表面疏水性Fig.4 The surface hydrophobicity of protein of oat dough with different β-glucanase content

3 結論

加入β-葡聚糖酶后，面團的吸水率、弱化度、彈性模量（G′）和粘性模量（G″）顯著降低，高燕麥含量面團的加工性能得到顯著改善，在β-葡聚糖酶的作用下，面筋蛋白的SDS可萃取蛋白含量增加，表面疏水性降低，蛋白的二級結構由無規則卷曲和β-轉角轉變為β-折疊，面筋蛋白的水合和聚集程度增加。這與β-葡聚糖的含量和聚合度降低，β-葡聚糖的持水能力減弱有關。研究結果表明，β-葡聚糖酶對減弱大分子量 β-葡聚糖對面筋蛋白結構的劣化作用具有積極作用，促進了面團蛋白質之間的聚集。β-葡聚糖酶能造成面團β-葡聚糖平均分子量的下降，6 u/g的酶量能保留原始面團84%的β-葡聚糖，顯示其有在高燕麥含量面團加工和烘焙過程中的應用前景。