兩株高效降解玉米蛋白粉益生菌的發酵特性研究

任 菲，劉玉春，王 超，郭 超，張維清

（國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037）

玉米蛋白粉是玉米加工的主要副產物，產量巨大[1-3]。但由于其醇溶蛋白含量較高及氨基酸組成不平衡，嚴重制約其應用，大多被當作飼料原料[3-5]。微生物分泌的蛋白酶能將蛋白粉中難溶的植物蛋白質降解并產生具有多種生理活性的肽類，因此，利用微生物發酵過程加工玉米蛋白粉具有廣闊應用發展前景[3-7]。張智等[8]確定了枯草芽孢桿菌ls-45制備玉米肽的最佳發酵條件；徐艷陽[7]等對納豆芽孢桿菌水解玉米蛋白粉產玉米肽的工藝進行了優化；文超婷等[9]優化了羊肚菌發酵玉米蛋白液體發酵培養條件。但是，目前面臨適宜發酵微生物資源認識和開發不足以及相應發酵工藝建立等問題[3-4]，尤其是篩選獲得高效蛋白酶活性的菌株及相應發酵工藝條件優化成為當前研究的重點。

本研究從傳統自然發酵豆醬樣品中，通過玉米蛋白粉固體篩培法和福林酚法等分離篩選到高效降解玉米蛋白粉的益生菌，并通過單因素發酵實驗和正交實驗對單菌株及其菌株組合發酵玉米蛋白粉的條件進行了優化。研究為提升優化微生物發酵玉米蛋白粉的條件工藝及其應用奠定基礎。

1 材料方法

1.1 實驗材料

自然發酵豆醬樣品：市購；可溶蛋白含量測定試劑盒、DPPH自由基清除能力試劑盒：蘇州格銳思生物科技公司；TIANamp Bacteria DNA Kit：北京天根生化科技有限公司；無水碳酸鈉溶液、三氯乙酸溶液、磷酸緩沖液（pH分別為4.5、7.2、9.3）：上海麥克林生化科技有限公司；酪蛋白、福林酚：北京索萊寶科技有限公司；配制培養基的各種樣品、試劑，均為國產分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

冷凍干燥儀（ALPHA2-4）：德國Chris Marin公司；pH計（FE20K）：瑞士METTLER TOLEDO公司；振蕩培養箱（SHK-99-II）：北京北方同正生物技術發展有限公司；微型旋渦儀（V2S02S）：德國 IKA公司；酶標儀（SynergvHT）：美國BIOTEK 公司；臺式高速冷凍離心機（EPPENDORF 5810R）：德國EPPENDORF公司；PCR儀（C1000 Touch）：美國BIORAD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株篩選、蛋白酶活性測定及菌種鑒定

研究中所用玉米蛋白粉平板篩選培養基，玉米蛋白粉基礎發酵培養基及玉米蛋白粉優化發酵培養基參考文獻王雨婷等[3]，參照相關文獻[3-4]，菌株篩選采用玉米蛋白粉平板篩選培養基觀察并測定菌落周圍透明圈的大??；蛋白酶活性測定按照國標福林酚試劑法測定發酵液中上清液的蛋白酶活性；菌株鑒定，提取目標菌株基因組DNA，PCR擴增其16S rDNA，PCR產物由上海生工生物科技有限公司測序，測序結果采用 DNAMAN軟件序列圖譜校對拼接，并在 NCBI數據庫中進行同源序列比對鑒定。

1.3.2 菌株玉米蛋白粉發酵實驗

平板活化菌株HDJ1和HDJ2后接種于LB培養基中培養，再將此種子液接種于玉米蛋白粉基礎發酵培養基中，以初始pH 8.0、接種量5%、搖床轉速150 r/min、溫度30 ℃、培養時間48 h為基礎初始發酵條件，采用單因素及正交實驗對培養基玉米蛋白粉含量、培養基初始pH、接種量、發酵溫度、搖床轉速、發酵時間及裝液量等工藝參數進行優化。可溶蛋白含量測定采用可溶蛋白含量測定試劑盒。

1.3.3 菌株玉米蛋白粉發酵液冷凍干燥及凍干粉生理生化性質測定

對玉米蛋白粉發酵液進行冷凍干燥，先-80 ℃冷凍，經過降溫，抽真空和主干燥，溫度控制在-75～85 ℃之間，壓強0.08 Mpa。

活菌數的測定。平板計數法，取10 g樣品于裝有90 mL無菌水的三角瓶中，振蕩20 min，搖勻，稀釋到一定的梯度，取三個梯度進行涂布，每個梯度設置 3組平行，倒置于 37 ℃恒溫培養箱中培養，待計數。蛋白酶活的測定采用國標同1.3.1. DPPH自由基清除能力通過DPPH自由基清除能力試劑盒測定。

1.4 數據分析

本文中相關數據計算、處理及作圖都利用軟件Microsoft Excel 2019進行。

2 結果與討論

2.1 菌株篩選、鑒定及蛋白酶活性測定

從自然發酵豆醬樣品中分離篩選到兩株出現明顯透明水解圈菌株，菌株號分別為 HDJ1和HDJ2，其透明水解圈圖片見圖1，透明圈（H/C）值分別為2.2和2.4。

圖1 菌株在玉米蛋白粉固體篩選培養基上水解透明圈圖Fig.1 Hydrolytic transparent circles of microbial strains of corn gluten meal screening medium

基于 16S rDNA序列的分子鑒定通過 NCBI BLAST比對確定菌株分類地位。結果顯示，篩選獲得的細菌菌株 HDJ1為枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis，另一株HDJ2為貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis（表1）。

表1 菌株篩選鑒定結果及菌株蛋白酶活性Table 1 Identification of two stains and the protease activity U/mL

依據國標福林酚試劑法測定了菌株蛋白酶活性（表1）。從研究結果可看出，菌株具有較高的蛋白酶活性。兩菌株間蛋白酶活性比較顯示，HDJ1酸性蛋白酶和中性蛋白酶活性低于HDJ2，而堿性蛋白酶活性高于HDJ2，說明HDJ1和HDJ2有各自更適合分解的蛋白種類。研究還表明兩菌株共培養可極大地提升蛋白酶的活性，酸性、中性和堿性蛋白酶活性都有增加，比單菌株蛋白酶活大多提高1倍以上。說明菌株組合能改善和提高蛋白分解效率。

芽孢桿菌是國際上普遍應用的生防細菌，是食品生產加工菌，也是微生物飼料和微生物生態制劑的研究熱點之一[10-11]?？莶菅挎邨U菌分布廣泛，能夠幫助生物防治馬鈴薯黃疫病等多種病害[10-11]，還能夠合成分泌蛋白酶、脂肪酶等多種酶類，也是發酵玉米蛋白粉的重要菌株資源[10-12]。貝萊斯芽孢桿菌能分泌多種生物活性物質，抑制包括稻瘟病病原菌、梨灰霉在內等多種病原菌，并且促進植物生長；添加于飼料中還可促進動物生長[13-15]。本研究中的菌株均有酸性蛋白酶、中性蛋白酶及堿性蛋白酶活性，并且具有顯著的組合培養協同提效分解蛋白的作用，應用潛力巨大。

2.2 菌株發酵玉米蛋白粉單因素發酵工藝優化

對菌株進行了發酵溫度、發酵初始pH、底物玉米蛋白粉含量、搖瓶轉速、菌株接種量及裝液量加液體積的發酵玉米蛋白粉單因素發酵條件的優化。HDJ1和HDJ2單菌株在40 ℃發酵液可溶蛋白含量最高，而組合（HDJ1+HDJ2，等量）發酵液可溶蛋白含量在30 ℃最高（圖2）；50 ℃時，可溶性蛋白含量仍較高。pH 8時，HDJ1、HDJ1和HDJ2組合發酵液可溶蛋白含量最高，HDJ2則在pH 6時最高（圖2）。HDJ1在接種量6%，底物濃度8%，轉速200 r/min，加液體積40 mL，發酵時間72 h可溶蛋白含量最高；HDJ2在接種量9%，底物濃度8%，轉速150 r/min，加液體積120 mL，發酵時間 72 h可溶蛋白含量最高；而 HDJ1和HDJ2等量組合在接種量6%，底物濃度8%，轉速250 r/min，加液體積40 mL，發酵時間96 h下可溶蛋白含量最高（圖2和表2）。而裝液量即加液體積變化不明顯，以下選擇80 mL/300 mL裝瓶液量。

圖2 單因素對可溶蛋白含量的影響Fig.2 Effect of single factor on soluble protein content

表2 發酵時間單因素表Table 2 Fermentation time factor

2.3 菌株發酵玉米蛋白粉發酵正交實驗

在單因素實驗的基礎上，選定底物濃度、種子液的接種量、初始pH、搖床轉速、發酵溫度、發酵時間6個因素，采用L18(36)正交實驗設計進行研究（表3）。各組正交實驗設計和實驗數據見表4（HDJ1）、表5（HDJ2）及表6（HDJ1+HDJ2）。由正交實驗分析表比較各因素對可溶性蛋白含量的極差大小及平均值可看出，不同因素對可溶蛋白含量影響由大到小HDJ1為RA＞RE＞RD＞RF＞RB＞RC，HDJ2 為 RA＞ RB＞ RE＞RC＞RD＞RF。HDJ1+HDJ2為 RA＞RE＞RD＞RF＞RC＞RB。正交實驗結果顯示HDJ1、HDJ2、HDJ1和 HDJ2組合在發酵溫度30 ℃，發酵pH 8，接種量3%，底物濃度8%，轉速200 r/min，發酵時間96 h條件下發酵液可溶蛋白含量最高。

表3 L18(36)正交實驗設計Table 3 L18(36) Orthogonal experimental design

表4 HDJ1正交實驗分析表Table 4 HDJ1 Orthogonal test analysis table

表5 HDJ2正交實驗分析表Table 5 HDJ2 Orthogonal test analysis table

表6 HDJ1+HDJ2正交實驗分析表Table 6 HDJ1+HDJ2 Orthogonal test analysis table

2.4 玉米蛋白粉發酵后發酵液生理化生化指標的測定結果

玉米蛋白粉微生物發酵后發酵液進行了冷凍干燥，制成發酵玉米蛋白肽粉。發酵后樣品可溶蛋白含量、DPPH清除率等顯著提高，特別是可溶蛋白含量增加明顯（表7），其中 HDJ1+HDJ2發酵液干燥粉可溶蛋白含量為231.2 mg/g。水溶性顯著提高正是由于發酵過程中微生物分泌的各種蛋白酶類將玉米蛋白粉中難溶的大分子蛋白質降解為分子量較小的多肽，增加了可溶性。

表7 玉米蛋白粉發酵前后生化指標對比Table 7 Comparison of biochemical indexes of corn gluten meal before and after fermentation

已報道常用于玉米蛋白粉發酵的微生物有芽孢桿菌、米曲霉、黑曲霉等[1-9]。王雨婷等[3]報道枯草芽孢桿菌菌株X1-1在接種量6%，發酵溫度36 ℃，轉速180 r/min，發酵時間72 h為其液態發酵玉米蛋白粉的最佳條件。其發酵液經噴霧干燥得到樣品的蛋白酶活為2 217 U/g，粗蛋白以及小肽含量提高了1.81倍和5.35倍。并提出底物濃度限值可能與發酵底物中含有較高濃度的硫化物從而對微生物的發酵產生抑制作用有關[3]。關于硫化物對菌株發酵的抑制作用我們在今后的實驗也將進一步研究。向麗蓉等[16]通過單因素和正交實驗，發現黑曲霉 L289在培養時間 5 d，溫度34 ℃，裝液量40 mL，底物濃度5%下發酵最佳，發酵液中氨基酸含量達2 718.05 μg/mL。另有研究對納豆芽孢桿菌及羊肚菌等單菌株發酵條件進行了優化[7,9]。關于復合菌發酵玉米蛋白粉研究，魏炳棟等[17]對復合菌（黑曲霉、乳酸菌、酵母菌和地衣芽孢桿菌）發酵玉米蛋白粉的條件進行優化，通過正交實驗研究發現最優接種比例為地衣芽孢桿菌 4%、乳酸菌 4%、酵母菌 6%、黑曲霉6%，發酵溫度35 ℃、發酵時間84 h、含水量45%、初始pH為6為最佳發酵條件，在此條件下多肽得率可達44.03%。篩選獲得高蛋白酶活性的菌株資源及相應發酵工藝條件優化是微生物發酵玉米蛋白粉研究的重點，是后續菌株改造和投入應用的基礎，還需加強相關研究。而本研究中兩菌株發酵效果優于單株菌也提示我們今后進一步對菌株間相互作用關系和作用機理進行探究。

3 結論

篩選玉米蛋白粉高效降解益生菌，利用益生菌發酵玉米蛋白粉產肽的研究和其發酵工藝條件的優化具有重要的意義。本研究通過固體篩培法篩選到兩株玉米蛋白粉高效降解菌株 HDJ1和HDJ2。通過單因素發酵實驗優化 HDJ1菌株、HDJ2菌株、及HDJ1和HDJ2等量組合液態發酵玉米蛋白粉的最佳條件（可溶蛋白含量最高條件）。正交實驗結果顯示 HDJ1、HDJ2、HDJ1和HDJ2等量組合在發酵溫度30 ℃，發酵pH 8，接種量3%，底物濃度8%，轉速200 r/min，發酵時間96 h條件下發酵液可溶蛋白含量最高。經益生菌菌株發酵后發酵液冷凍干燥后樣品蛋白酶活、可溶蛋白含量、DPPH清除率等顯著提高，并且兩菌株組合后的發酵效果優于單株菌。通過本研究也證實了微生物發酵的確能提高可溶蛋白含量。后續將進一步進行玉米蛋白粉益生菌發酵產玉米肽的研究和優化發酵工藝的探索，以期將為玉米加工副產物蛋白粉的增值利用奠定基礎。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網（http://lyspkj.ijournal.cn）、中國知網、萬方、維普、超星等數據庫下載獲取。