發酵條件對小米酸粥中多酚含量的影響及其主要組分研究

郭 璞，王曉聞,2?，張宏麗，康 淼

（1. 山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030600；2. 山西省功能食品研究所，山西 晉中 030600）

小米是我國一種常見的食用谷物，它含有豐富的脂肪酸、維生素、較高的膳食纖維、豐富的色氨酸與酚類物質。中醫認為，小米“和胃溫中”，將小米煮成粥食用，可以清熱解毒、治療反胃熱痢，還具有健胃消食的功效[1-2]。除了作為小米粥食用外，小米還被制成小米餅，小米鍋巴等食品。在山西西北部，小米經常被發酵成酸粥食用。酸粥是一種由糜米、大米和小米發酵而成的在我國具有悠久歷史的傳統食品，當地的酸粥一般選用當地的出產的谷物，因此其風味與營養組分也略有區別。酸粥作為一種發酵食品富含多種人體所必須的維生素，如維生素B、葉酸、維生素E等，同時這些維生素也可以有效的提升人體對其中豐富的礦物質的吸收，由此可見酸粥是一種優秀的功能食品[3]。

近些年，關于酸粥的研究主要集中于制作方法與發酵菌類分析上。例如秦慧彬[4]等對不同菌種發酵酸粥進行研究，發現以戊糖乳桿菌h8-c為初始菌種發酵的酸粥口味更加純正。王琪[5]等則研究了晉西北酸粥中多株乳酸菌的抗氧化性、對膽鹽的耐受性及對膽固醇的降解率，證明了晉西北酸粥中的乳酸桿菌具有潛在的益生特性。劉金輝[6]等還提取了天然發酵酸粥中的植物乳桿菌TK9，證明其對羅氏青霉、草青霉等食品腐敗相關菌種有明顯抑制作用，并且可以有效地延長食品的貨架期，具有很好的商業價值。然而針對發酵酸粥中多酚含量變化及其主要營養成分的研究仍然較少。

本研究中，以山西傳統小米酸粥作為研究對象，探究發酵溫度與時間對發酵小米酸粥中多酚含量變化的影響，并對比發酵小米酸粥與同處理小米粥成分差異，為小米酸粥的產品研發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

酸漿：山西太谷縣；小米（東方亮）：山西晉中超市；福林酚、沒食子酸（標準品）、色氨酸（標準品）：北京索萊寶有限公司；無水乙醇、甲醇、無水碳酸鈉、甲醇等試劑：上海阿拉丁有限公司。

1.2 儀器與設備

W-CJ-2FD 型凈化工作臺：蘇州按采空氣技術有限公司；HH-B11·42OBY型電熱恒溫培養箱：上海躍進醫療器械有限公司；DGL-GI型立式蒸汽滅菌器：上海力辰儀器科技有限公司；UV-1100型 可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；HSJ恒溫水浴鍋：江蘇科析儀器有限公司；SC-3610低速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；SCIENTZ-18N型冷凍干燥機：寧波新芝生物科技有限公司；安捷倫LC-1200液相色譜儀：北京安捷倫科技（中國）有限公司；SXW-4-13型馬弗爐：上海實研電爐有限公司；BSA124S電子天平：德國賽多利斯集團；OLBX-10S型石墨恒溫消化爐：深圳歐萊博科技有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海篤特科學儀器有限公司；ST3100/F型實驗室臺式酸度計：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預處理

參考康子悅[7]等的方案，并稍作修改。小米用清水清洗，在瓷盤上鋪成1 cm厚，紫外滅菌2 h，期間不斷翻攪保證滅菌均勻，滅菌后的小米密封在4 ℃貯藏備用。

1.3.2 小米粥制備

將小米以1∶25料液比放入鍋中煮制，待水沸后計時15 min。將煮制后的小米粥晾涼。凍干后儲藏在-20 ℃。

1.3.3 小米酸粥制備

1.3.3.1 工藝流程 稱取70 g 1.3.1預處理的小米于滅菌后的250 mL三角瓶中，加入100 mL酸漿作為發酵引子，然后加滅菌后的水至250 mL，密封發酵容器，恒溫培養箱中發酵。將發酵后的小米酸粥倒至鍋中，加水將料液比補至與小米粥相同，煮制，待沸騰后繼續煮制15 min。晾涼后凍干，貯藏在-20 ℃備用。

1.3.2.2 小米酸粥樣品制備優化 采用單因素實驗設計，以多酚含量為主要指標，酸度為參考指標，考察溫度及時間對小米酸粥發酵的影響。按照1.3.2.1的方法，分別在27、32、37、42 ℃發酵20 h，篩選最佳發酵溫度。然后在最適發酵溫度下發酵，分別發酵4、8、12、16、20、24、28 h選擇最適發酵時間。所有實驗重復三次，結果取平均值。

1.3.3 小米粥及小米酸粥中各成分測定

總酸含量：采用GB 12456—2021《食品中總酸的測定 滴定法》；

總酚含量：采用Folin-Ciocalteu法[8]測定；

淀粉含量：采用GB 5009.9—2016《食品中淀粉的測定 酶水解法》；

脂肪含量：采用GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定 索氏抽提法》；

蛋白含量：采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定 凱氏定氮法》；

灰分含量：參考GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》；

總膳食纖維、可溶性膳食纖維、不可溶性膳食纖維含量：參考GB 5009.88—2014《食品中膳食纖維的測定》；

色氨酸含量：GB/T 15400—2018《飼料中色氨酸的測定 高效液相色譜法》。游離色氨酸使用米粥上清液進行檢測，而水解色氨酸含量使用酸水解法檢測。

1.3.4 小米粥及小米酸粥多酚提取物抗氧化性檢測

2,2-聯苯基-1-苦基肼基（DPPH）清除率檢測參照康子悅[7]等的方案進行。羥自由基清除能力采用索萊寶羥自由基清除能力試劑盒檢測。按照說明書進行實驗并重復三次。在96孔板中每孔加入50 μL試劑一，100 μL試劑二和100 μL試劑三，充分混勻。空白孔中加入70 μL蒸餾水，對照孔中加入20 μL試劑四以及50 μL蒸餾水，樣品孔中加入50 μL1.3.3中多酚含量檢測提取的多酚樣品以及20 μL蒸餾水，混勻37 ℃反應20 min。使用酶標儀于536 nm處檢測吸光度值，按下列公式進行計算：

式中：D-羥自由基清除率（%）；A測-樣品吸光度值；A對-對照孔吸光度值；A空-空白孔吸光度值。

1.4 數據分析

通過 SPSS 16.0進行數據分析，當兩組間P＜0.05時認為兩組間存在顯著差異，使用GraphPad Prism 8進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 發酵溫度對小米酸粥總酚總酸的影響

微生物的生長代謝與環境溫度密切相關，因此溫度是生物發酵的一項重要指標。如圖2所示，隨著溫度的升高，總酚及總酸含量均呈現先升高后降低的趨勢。當溫度為 27 ℃時，溫度較低，產酸細菌繁殖較慢，產酸能力較弱，酸度較低。同時，在較低的溫度下，小米酸粥發酵產生多酚的過程也受到了抑制。當溫度為 42 ℃時，環境溫度較高，不利于微生物的生長繁殖，由圖中數據可知，在此溫度下小米酸粥酸度較低，且小米酸粥中一部分乳酸可能來源于發酵時加入的酸漿引子，推測較高的溫度可能殺死酸粥菌液中的一部分菌種，使得小米酸粥產酸產多酚能力進一步下降。而在32～37 ℃時，小米酸粥產酸產多酚能力較強，總酸含量達到46.37 g/kg和50.90 g/kg，且總酚含量達到1.18 mg/g和1.08 mg/g。

圖1 發酵溫度對酸粥總酸含量與多酚含量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on total acid content and polyphenol content of sour congee

圖2 發酵時間對酸粥總酸含量與多酚含量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on total acid content and polyphenol content of sour congee

2.1.2 發酵時間對小米酸粥總酚總酸的影響

研究表明酸粥中富含多種產酸菌類[5,9]。如圖2所示，隨著時間的增加，小米酸粥中總酸含量逐漸上升，4～12 h上升較慢，而12～20 h小米酸粥酸度上升顯著，可能是隨著乳酸的積累，小米酸粥中 pH逐漸降低，形成利于乳酸菌等產酸菌種生長繁殖的環境，因此產酸量增加，總酸含量迅速上升。而到20 h后，小米酸粥酸度趨于平穩，可能是隨著時間的流逝，小米酸粥環境中的底物被迅速消耗導致的。

多酚類物質是小米中的重要功能成分，包括多種游離酚、黃酮類物質以及結合態的共軛酚酸[10]。研究表明，酸粥中含有多種乳酸菌與枯草芽孢桿菌[11]。這兩種菌被證明可以通過發酵來產生多酚類物質[12-13]。其原理可能是原先附著于蛋白或淀粉結構內部的酚類物質，通過發酵的過程被釋放出來，從而增加了發酵產品多酚的含量。如圖2所示，隨著時間的增加，小米酸粥內多酚含量逐漸升高。其升高趨勢與總酸含量相近，表明多酚含量的增加可能與乳酸菌等產酸菌種相關。多酚含量在20 h處達到頂峰，之后無顯著差異。可能是由于底物中多酚類物質被完全釋放，但也不排除其原因是小米酸粥發酵過程中菌種變化導致的，具體原因還有待進一步實驗考察。

結合2.1.1的研究結果，在32 ℃發酵20 h可以使小米酸粥中總酚及總酸含量達到最佳。在此條件下總酚含量達到 1.18 mg/g，總酸含量達到46.37 g/kg。

2.2 小米酸粥中其他營養成分與小米粥的差異

2.2.1 發酵對小米粥多酚含量的影響

小米熱處理會導致多酚含量顯著降低。Taylor[14]等分析了脫皮、蒸煮、發芽處理后小米中多酚含量的變化，發現小米中多酚含量與食品加工程度程負相關，并且發現小米加工過程中多酚含量變化受到多酚變性與結合態多酚釋放兩方面調控。如圖3所示，在本實驗中，與小米粥相比，小米酸粥中多酚含量顯著上升。此外，我們還檢測了小米中多酚的含量，發現蒸煮處理使小米中多酚含量降低了60%，這與Taylor[14]等的研究結果一致，而發酵后多酚含量達到小米粉中多酚含量的60%。證明酸粥發酵可以有效地彌補熱處理產生的小米多酚損耗。

圖3 小米粥與小米酸粥主要營養成分對比Fig.3 Comparison of main nutritional components between millet congee and millet sour congee

2.2.2 小米粥發酵對多酚抗氧化性的影響

實驗分別提取了小米、小米粥、發酵小米酸粥中的多酚，并對其抗氧化能力進行檢測。與小米多酚相比小米粥多酚的DPPH清除率及羥自由基清除率分別降低了5.56%和23.46%，而發酵小米酸粥中多酚的這兩項指標分別降低了 1.62%及14.93%。實驗證明煮制會顯著降低小米中多酚的抗氧化活性，而發酵可以明顯減少因煮制而產生的小米粥多酚抗氧化活性減弱。

表1 小米、小米粥與小米酸粥中多酚的抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of polyphenols in millet, millet congee and millet sour congee %

2.2.3 發酵對小米粥主要營養組分的影響

結合單因素實驗的結果，本實驗選取了在32 ℃發酵20 h的小米酸粥凍干樣品，比較它與相同料液比及煮制時間的小米粥凍干樣品的主要營養成分。結果如圖3所示。經過發酵后，小米酸粥中的蛋白及油脂含量相較于小米粥有明顯上升，而淀粉含量明顯下降，這與郭昊翔[3]等的研究結果一致。一方面，伴隨著微生物的生長繁殖，小米中的淀粉及其他營養物質被當作碳源加以利用，作為自身的能量供給，導致淀粉含量下降。另一方面，小米酸粥中微生物在發酵過程中利用一些小分子物質合成新的營養物質，導致小米酸粥中如蛋白、脂肪等營養物質含量增加，如酵母菌發酵過程中利用醇和酸合成酯類物質，導致粗脂肪含量增加。此外，發酵小米酸粥與小米粥之間灰分含量沒有顯著差異，說明發酵過程純凈，并沒有引入新的無機鹽。

2.2.4 小米粥發酵對色氨酸含量的影響

小米中含有豐富種類的氨基酸，其中含量最高的是色氨酸。色氨酸是一種主要由飲食攝入的必需氨基酸，被認為是一種重要的代謝途徑調節因子，在多條代謝通路中起到調節作用[15]。另外還有研究指出色氨酸可以有效地保護腸道屏障穩態，因此富含色氨酸的食物被認為可以作為腸道保護的膳食補充劑開發利用。

在本實驗中，我們利用液相色譜檢測了小米酸粥與小米粥中的游離色氨酸含量與水解色氨酸含量。發現與小米粥相比，小米酸粥中水解色氨酸含量并沒有發生顯著的變化。而小米酸粥中游離色氨酸含量相較小米粥顯著增加。說明發酵過程釋放了部分小米中的色氨酸，使色氨酸變為游離態。

圖4 小米粥與小米酸粥色氨酸含量對比Fig.4 Comparison of tryptophan content between Millet Congee and millet sour congee

2.2.5 小米粥發酵對膳食纖維含量的影響

膳食纖維（dietary fiber, DF）是指一類不能被小腸消化吸收而可以在大腸部分發酵的可食用的植物性成分、碳水化合物及其相似物質的總稱[16]。根據是否可以被水溶解分為兩大類：可溶性膳食纖維及不溶性膳食纖維。很多年以前，由于膳食纖維不能被消化吸收為人體提供能量，因此并不被研究者所重視。但近些年，隨著對營養學研究的深入發展，人們漸漸發現膳食纖維具有治療腸道疾病[17]、降低血糖[18]、抗腹瀉[19]等多種作用。因此膳食纖維也被研究人員稱為第七營養素。

在本研究中，我們分別檢測了小米粥凍干粉與小米酸粥凍干粉的膳食纖維含量，結果如圖5所示。對比小米粥與小米酸粥中膳食纖維含量，小米酸粥發酵明顯增加了總膳食纖維含量。有研究表明，枯草芽孢桿菌的發酵會顯著增加發酵食品中的膳食纖維含量[20]，我們推測這可能是膳食纖維的來源菌。另外與小米粥相比小米酸粥中的可溶性膳食纖維含量沒有顯著差異，而不可溶性膳食纖維含量明顯增多，證明發酵過程主要產生的是不可溶性膳食纖維。

圖5 小米粥與小米酸粥膳食纖維含量對比Fig.5 Comparison of dietary fiber content between Millet Congee and millet sour congee

3 討論和結論

在中國，小米作為一種重要的雜糧被廣泛的種植與食用。小米中營養成分均衡，因此經常作為主食食用。發酵是一種傳統的食品生產方式，人們通常通過發酵谷物與水果改變食物原有的形態與風味。此外，發酵還改變了食物原有的營養結構，為人們提供更為豐富的營養補充。郭昊翔[3]等利用電子舌和電子鼻對內蒙發酵酸粥中的營養成分及風味進行檢測，研究發現發酵過程增加了酸粥中的蛋白及總酸含量，降低了酸粥中總糖含量，此外發酵還增加了酸粥中葉酸、維生素C等維生素的含量。薛建崗[21]等對內蒙古地區酸粥進行取樣并分析其化學成分，發現除總固形物外，不同地區發酵酸粥中營養成分有較大差異。另外酸粥中還富含乙酸、γ-氨基丁酸等天然活性成分。本研究則分析了晉西北發酵酸粥中的不同營養成分，與內蒙酸粥相比，晉西北小米酸粥中蛋白、脂肪、灰分含量更高，推測可能是由于不同地區原料選擇與配比不同造成的。此外，我們還發現發酵會使小米粥中多酚含量增加，結合上述研究成果，可以得知發酵酸粥中含有豐富的維生素、氨基酸、以及多酚類物質，是一種健康的傳統發酵食品。然而，本實驗并未涉及發酵對小米粥多酚種類的影響，并且不同營養成分變化可能部分源自于發酵菌種而非小米酸粥。因此，計劃下一步針對發酵小米酸粥中多酚及不同營養成分進行具體分析。

通過對酸度及多酚含量進行檢測，探究了發酵時間與溫度對小米酸粥發酵的影響。單因素實驗結果表明，小米酸粥中總酸含量及多酚含量均會隨時間而升高，兩者均在20 h處達到頂峰。而發酵過程在32～37 ℃較為活躍，其中32 ℃左右多酚產量最高。對小米酸粥凍干粉與小米粥凍干粉中營養物質含量檢測發現，發酵過程會增加小米粥中蛋白、脂肪和多酚含量，降低淀粉含量。另外小米酸粥發酵還會提高不可溶性膳食纖維與游離色氨酸含量。由于凍干樣品中同時含有大量菌種，營養物質的變化可能源自于菌種自身，因此還需要進一步地分析各營養成分具體的變化，如蛋白種類的分析，來確定發酵過程對小米本身的影響。因此計劃下一步對小米酸粥中營養物質進行進一步的分析，以便更好地闡述發酵過程對小米酸粥功能成分的影響。