凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)循環水養殖系統中養殖效果及菌群結構和功能研究*

唐亞鵬 董世瑞 田吉騰 周 茜 王印庚 張天時

凡納濱對蝦()循環水養殖系統中養殖效果及菌群結構和功能研究*

唐亞鵬1, 2董世瑞3田吉騰1周 茜1, 2王印庚1, 2張天時1, 2①

(1. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 山東青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 山東青島 266237; 3. 天津市食品生物技術重點實驗室 天津商業大學生物技術與食品科學學院 天津 300134)

循環水養殖可有效減少病原體的入侵, 是我國水產養殖業發展的重要方向。為完善凡納濱對蝦()循環水養殖系統, 采用生態調控、16S rRNA高通量測序、宏基因組學分析與數理統計等方法, 系統分析了對蝦循環水養殖系統中水質指標變化與菌群結構和基因功能的關系。結果顯示, 養殖池水質指標包括溫度、溶解氧、鹽度、pH以及氨氮0.11～1.16 mg/L, 亞硝酸氮0.10～0.66 mg/L, 硝酸氮0.84～35.40 mg/L均在安全范圍內; 經過63 d養殖, 凡納濱對蝦平均體重達到11.78 g左右, 產量為3.28 kg/m3左右, 存活率為69.59%左右。菌群結構與功能分析結果顯示: 在開始運行期與水質變化平穩期生物濾池中菌群結構差異較大。在開始運行期海桿菌屬(31.37%)占絕對優勢, 而在平穩期則以分枝桿菌屬(6.65%)、分枝菌酸桿菌屬(6.39%)、食烷菌屬(5.21%)、海桿菌屬(3.36%)、中慢生根瘤菌屬(2.30%)、紅桿菌屬(1.34%)、副球菌屬(1.29%)等反硝化細菌和硝化桿菌屬(1.17%)占據優勢。通過比對KEGG數據庫發現涉及碳水化合物代謝和氨基酸代謝的蛋白數目最多, 說明異養反硝化菌需要利用多種碳源來執行反硝化功能。

循環水養殖; 凡納濱對蝦; 高通量測序; 宏基因組學; 菌群結構

凡納濱對蝦()是世界范圍內最主要養殖的對蝦品種。近年來, 隨著養殖規模的擴大及高密度養殖模式的發展, 病害、養殖環境惡化及環境污染等問題困擾著對蝦養殖業的進一步發展。循環水養殖具有節電、節水、節地等優點, 并可有效減少病原體的入侵, 是我國水產養殖業發展的重要方向(臧維玲等, 2008; Holl, 2011; 王峰等, 2013; 黃志濤等, 2016; 張龍等, 2019; 洪越群等, 2019)。

循環水養殖系統的核心是通過硝化細菌將氨氮或亞硝態氮轉變成為毒性較小的硝態氮, 再通過反硝化細菌將硝酸鹽轉化為氣態氮(李秀辰等, 2010; Van Rijn, 2013; 劉文暢等, 2016; Qiu, 2016)。因此, 形成有效的功能菌群是維持養殖水環境穩定的重要前提。近年來, 開展了許多循環水系統中功能菌群的研究(李秋芬等, 2011; 王威, 2012; Auffret, 2013)。但這些研究結果多關注菌群結構組成與水質調節作用的關系, 對菌落中發揮主要作用的功能基因的報道較少。

此外, 養殖環境與對蝦疾病的發生有密切的關系, 通過研究養殖環境中的微生物群落結構和多樣性以及它們與環境間的相互關系對控制蝦病的發生有重要意義。近年來, 已有較多有關對蝦養殖水體中微生物群落組成和養殖環境變化關系的報道(Johnson, 2008; Sakami, 2008)。其中Tang等(2014)比較了南美白對蝦養殖池塘高水溫(≥30 °C)和低水溫(≤20 °C)條件下的細菌群落組成, 發現放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)是高水溫和低水溫條件下豐度最高的門, 且檢測到大量未分類的細菌; 與低水溫相比, 在屬和種水平上, 高水溫樣本中的細菌群落有更高的豐富度和多樣性, 同時發現了一些致病菌, 證明環境因子溫度是細菌群落的主要驅動因子。張皓(2015)開展了凡納濱對蝦養殖池塘水體及底泥環境微生物群落動態變化與水環境互作的研究, 探討了養殖環境中優勢細菌、益生菌和潛在致病菌之間的互作和動態變化關系, 證明水體中的氨氮(AN)、化學需氧量(COD)、總氮(TN)對水體中細菌種群影響較大, 不同種類微生物與水質指標相關性不同。

目前, 16S rRNA高通量測序與宏基因組學測序分析技術已成為表征微生物群落結構與功能的常規方法(Tringe, 2005; Oh, 2011; Bai, 2014; Sunagawa, 2015; Mitchell, 2018; Ta?, 2021)。本文采用16S rRNA高通量測序與宏基因組學分析等方法, 對凡納濱對蝦循環水養殖系統中生物濾池內細菌群落結構和功能進行分析, 結合養殖過程中養殖水體水質指標變化以及對蝦生長狀況, 為了解生物濾池中微生物在對蝦養殖水體水質調控中發揮作用的機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用凡納濱對蝦()蝦苗購自海南正大集團鋪前鎮種苗場, 在海陽市黃海水產養殖有限公司進行室內循環水養殖實驗, 養殖時間9～11月, 實驗共進行63 d。

1.2 方法

1.2.1 循環水養殖設施和操作 養殖池為半地下式溫棚水泥池, 3個水泥池(2#, 3#, 17#)大小均為10 m×8 m×1.8 m, 養殖水深約1 m。海水取自于砂濾井, 采用同一循環水水質處理系統。

濾料池填料采用自然掛膜工藝培養生物膜20 d, 之后將標粗后的蝦苗分苗到循環水車間。在養殖前期(30 d以前)、中期(30～50 d)、后期(50 d以后)的循環量分別為2、4、6～8循環/d。在養殖過程中對生物濾料池進行遮光處理。

1.2.2 日常管理與統計指標 對蝦標粗后, 初始放養密度為500尾/m2, 每天排污2～3次。養殖前期日投喂飼料3～4次, 養殖中后期日投喂2～3次。實驗結束時, 統計測量各池對蝦產量及數量, 計算成活率、生長率及餌料轉化率。對蝦生長性能測定參照張龍等(2019)方法。

1.2.3 水質指標測定方法 每隔7 d使用YIS6920型多功能水質測定儀測定水溫()、鹽度()、溶解氧(DO)、pH值; 采用五點取樣法采集水體表層以下約30 cm處水樣500 mL, 經過0.22 μm濾膜抽濾后的水樣, 用于氨氮、亞硝酸氮及硝酸氮質量濃度測定, 分別采用《海洋調查規范》(GB/T 12763.4—2007)中的靛酚藍分光光度法、萘乙二胺分光光度法和鋅鎘還原法測定。

1.2.4 菌群樣本的采集 根據水質指標變化, 在養殖第0～7 d (開始運行期, 記作Star)和第45～52 d (水質指標變化平穩期, 記作Stat), 每天取濾料池水樣通過0.22 μm濾膜抽濾得到細菌樣本放于–80 °C保存, 用于16S rRNA高通量測序。

1.2.5 基因組DNA的提取和檢測 將水樣的濾膜剪碎, 按照周敏等(2018)的方法對菌群宏基因組DNA進行分離和純化, 由上海派森諾生物科技股份有限公司做宏基因組測序。

1.2.6 16S rRNA測序分析 Star樣本進行16S rRNA高通量測序分析。基于OTU聚類的Vsearch (Rognes, 2016)方法進行序列拼接, 質量過濾, 去重, 聚類。采用QIIME2的classify-sklearn算法(Bokulich, 2018), 使用Naive Bayes分類器進行注釋。依據注釋結果統計樣本在各分類水平中含有的分類單元數量。

1.2.7 宏基因組測序 對Stat樣本進行宏基因組測序分析?；贗llumina HiSeq 4000高通量測序平臺進行雙端測序。使用Megahit(vl.0.6)進行序列組裝, 采用MetaGeneMark (Zhu, 2010)進行基因預測。KEGG數據庫進行基因功能注釋。通過BLASTN比對(<0.001), 使用MEGAN (Huson, 2011)軟件中的“最低共同祖先”算法(Huson, 2007), 將目標序列進行物種注釋分類, 獲得樣本在不同分類水平上的豐度信息。

2 結果與分析

2.1 水質指標變化

在養殖實驗過程中, 溫度、溶解氧、鹽度和pH動態變化如圖1所示, 3個養殖池常規水質變化趨勢基本一致, 其中, 溫度變化范圍為23.0～29.4 °C, 均值(25.92±0.06) °C, 呈逐漸下降趨勢, 隨養殖時間的延長氣溫逐漸下降造成水溫降低, 后期使用鍋爐加熱, 水溫有所回升; 溶解氧變化范圍為5.4～6.8 mg/L, 均值(6.03±0.04) mg/L, 在養殖過程中溶解氧呈現出波動變化, 可能與系統在內外循環、藻類增氧聯合作用有關(楊菁等, 2010); 鹽度變化范圍為24.5～30.8, 均值(27.92±0.05), 養殖后期鹽度逐漸上升, 可能是由于循環水養殖換水量少, 每次僅添加10%的換水量, 水分蒸發量大造成鹽度升高; pH變化范圍為7.5～8.2, 均值(7.92±0.03), 呈逐漸減小的趨勢, 這表明在養殖過程中, 養殖生物量逐漸增大, 對蝦呼吸作用加強以及有機物質分解產生的CO2是pH減小的主要原因(陳劍鋒等, 2006)。綜上所述, 本系統養殖環境符合凡納濱對蝦培養基本要求, 適合凡納濱對蝦的生長(林繼輝等, 2004; 沈麗瓊等, 2007; 楊菁等, 2010)。

圖1 養殖池水體的溫度、溶解氧、鹽度、pH值動態變化

氨氮、亞硝酸氮及硝酸氮質量濃度變化如圖2所示, 循環水養殖水體氨氮濃度呈逐漸上升趨勢, 亞硝酸氮濃度呈先上升后下降的趨勢, 其濃度變化范圍分別在0.05～1.16和0.11～0.67 mg/L, 均值分別為(0.59±0.07)和(0.31±0.01) mg/L。氨氮及亞硝酸氮主要來源于殘餌、糞便等有機物質的分解, 而且凡納濱對蝦排泄作用也可產生氨氮(宋協法等, 2009)。劉健等(2017)發現氨氮與亞硝酸氮質量濃度是凡納濱對蝦養殖中后期的主要限制因子, 在密閉式養殖過程中具有較大波動。本循環水養殖系統將氨氮及亞硝酸氮質量濃度控制在安全范圍內, 有利于保持良好水質, 促進對蝦生長(孫國銘等, 2002)。本研究中3個養殖池硝酸氮質量濃度均呈上升趨勢, 這與索建杰等(2015)研究結果一致。硝酸氮質量濃度變化范圍在0.84～ 35.40 mg/L, 均值(14.04±0.38) mg/L。臧維玲等(2008)在室內對凡納濱對蝦進行循環水養殖, 檢測硝酸氮質量濃度變化范圍在0.680～47.285 mg/L; 張龍等(2019)測得循環水養殖硝酸氮質量濃度最高值達到25.98 mg/L。硝酸氮對對蝦毒性作用較小, 濃度高于150 mg/L將對南美白對蝦的生長不利(彭自然等, 2004)。

2.2 對蝦生長性能

由表1可知, 經過63 d養殖, 對蝦平均體重達到11.46～12.21 g, 產量為3.14～3.54 kg/m3, 生長率在6.9%～7.5%之間, 存活率為67.16%～72.48%, 餌料轉化率為63.92%～80.13%。謝松平等(2015)在室內進行工廠化循環水養殖凡納濱對蝦125～140 d, 平均規格在80.6尾/kg, 平均單位水體產量為3.9 kg/m3, 成活率為42.8%。張龍等(2019)比較了不同養殖模式對凡納濱對蝦生長性能的影響, 發現經過85 d養殖, 循環水養殖凡納濱對蝦存活率(74.58%±1.74%)、飼料轉化率(70.56%±3.82%)和產量[(3.91±0.49) kg/m3]顯著高于流水養殖凡納濱對蝦存活率(66.90%±3.80%)、飼料轉化率(67.14%±3.25%)、產量[(3.47±0.42) kg/m3]。綜合以上數據, 本研究養殖效果較為成功, 其中17#養殖效果最好。

圖2 養殖池水體的氨氮、亞硝酸氮和硝酸氮質量濃度動態變化

表1 凡納濱對蝦養殖效果

Tab.1 The effect of L. vannamei culture

2.3 菌群組成豐度分析

根據16S rRNA測序結果, 將Stat和Star樣本在屬水平物種豐度信息進行統計, 選取相對豐度排名前10的菌屬(圖3), 結果顯示, 在循環水系統開始運行期和平穩期生物濾池菌群結構差異較大, 在Star期, 濾料池中優勢菌屬為海桿菌屬()、別樣海源菌屬()、、黃桿菌屬()、鹽單胞菌屬()、無色桿菌屬()、遠洋桿菌屬()、SM1A02、ML310M-34和, 相對豐度分別為31.37%、9.33%、8.21%、7.25%、6.10%、2.46%、2.35%、1.88%、1.75%、1.60%; 而在Stat期, 濾料池中優勢菌屬為(8.57%)、分枝桿菌屬(6.65%)、分枝菌酸桿菌屬(6.39%)、食烷菌屬(5.21%)、海桿菌屬(3.36%)、中慢生根瘤菌屬(2.30%)、固氮螺菌屬(1.42%)、紅桿菌屬(1.34%)、副球菌屬(1.29%)和硝化桿菌屬(1.17%)。

不同時期生物濾池菌群結構出現演替性變化, 從而保證了循環水系統運行過程中水質的穩定。張斌等(2008)在研究膜-生物反應器水質處理系統微生物群落演替過程中發現, 水質的改變會導致微生物群落結構多樣性降低, 在反應器不同運行時期, 會出現原種的消亡, 次級種群的強化和演變等過程。張海耿(2011)也發現在生物掛膜初期, 最先適應此環境的細菌迅速繁殖起來, 當系統運行后, 隨著生物濾池中的營養鹽成分逐漸趨于穩定, 一部分細菌在競爭中被淘汰, 而另一些細菌則慢慢成為優勢種群, 還有一些廣泛存在的優勢菌屬, 在系統內物質和能量的代謝中發揮著重要的作用。本研究中, 濾料池在Star期與Stat期菌群結構組成差異較大, 這可能是由于系統運行前期水質變化較大引起的。海桿菌為兩個時期共有的優勢菌屬, 海桿菌是一種廣泛存在的反硝化細菌, 能夠利用硝酸鹽和亞硝酸鹽作為氮源, 在反硝化作用下將其還原成氮氣, 從而達到脫氮的效果(巫亮等, 2014; Liu, 2016; 劉萬鑫等, 2017)。在生物濾池開始運行時期, 海桿菌占有絕對的優勢, 亞硝酸氮迅速下降而硝酸氮保持不變, 說明該階段主要由海桿菌反硝化作用占據優勢(孟盈盈, 2019)。

圖3 水樣菌群屬水平物種分布柱狀圖

注: a. Star; b. Stat

2.4 菌群基因功能分析

通過對比KEGG數據庫發現代謝通路中碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)和氨基酸代謝(amino acid metabolism)含有的蛋白數目最多(圖4), 分別為46 643個和40 092個, 這與呂小梅(2014)研究反硝化除磷污泥中菌群功能基因分布情況相似。

異養反硝化菌可以利用碳源作為電子供體, 將硝態氮或亞硝態氮還原為氣態氮, 而且利用有機碳可為反硝化菌提供物質和能量, 以供其生存和繁衍(劉剛等, 2010; 吉芳英等, 2013; 孫朦朦, 2014), 因此碳源對于細菌及反硝化過程起著重要作用。有研究表明, 在乳酸菌中碳代謝作為關鍵代謝顯著影響亞硝酸鹽的降解(潘晴, 2018)。此外, 氨基酸也可作為碳源被反硝化細菌所利用, 陳元磊(2015)發現在兩種反硝化細菌基因組中, 碳水化合物傳遞和代謝、氨基酸傳遞與代謝相關基因最多, 分別占預測基因的8.56%～11.21%、8.44%～10.22%。楊航等(2008)提出絲氨酸、丙氨酸、組氨酸以及亮氨酸均可作為反硝化作用的底物, 錢小青(2001)則發現反硝化脫氮菌能直接利用甘氨酸或丙氨酸作為唯一碳源進行脫氮。在本研究中, 丙酮酸代謝(pyruvate metabolism, 12.75%)、乙醛酸和二羧酸代謝(glyoxylate and dicarboxylate metabolism, 11.88%)在碳水化合物代謝中占有最高豐度; 甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(glycine, serine and threonine metabolism, 12.31%), 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解(valine, leucine and isoleucine degradation, 10.34%)在氨基酸代謝中占有最高豐度, 這說明在本系統中, 有多種氨基酸及二碳、三碳酸作為碳源共同參與反硝化過程。

圖4 KEGG代謝通路注釋結果

3 結論

本凡納濱對蝦循環水養殖系統在養殖初期氨氮與硝酸氮質量濃度逐漸上升, 水質變化逐漸趨于平穩, 但是本循環水養殖系統始終將氨氮及亞硝酸氮等水質指標濃度控制在安全范圍內, 有利于保持良好水質, 促進對蝦生長。通過菌群組成豐度分析, 在開始運行期與水質變化平穩期生物濾池中菌群結構差異較大。在開始運行期海桿菌屬占絕對優勢, 而在平穩期則以分枝桿菌屬、分枝菌酸桿菌屬、食烷菌屬、海桿菌屬、中慢生根瘤菌屬、紅桿菌屬、副球菌屬等反硝化細菌和硝化桿菌屬占據優勢。在水質穩定期的菌群基因功能分析中, 通過對比KEGG數據庫發現代謝通路中碳水化合物代謝和氨基酸代謝含有的蛋白數目最多, 也進一步說明水體中反硝化菌可以利用多種碳源進行反硝化作用來調節水質, 降低水體中亞硝酸氮濃度, 使氨氮及硝酸氮平穩變化。

綜上所述, 本研究通過16S rRNA測序及宏基因組測序技術, 對生物濾池中菌群結構及功能進行了分析, 結合養殖池水質指標變化, 發現對蝦循環水養殖系統菌群和水質變化具有明顯的時序特征, 在水質變化穩定期亞硝酸鹽得到有效控制, 反硝化細菌為優勢菌, 可利用多種碳源進行反硝化作用。本次研究結果將為循環水養殖系統中菌群結構與環境因子互作提供參考, 為菌群結構和功能定向調節提供依據。

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STUDY ON STRUCTURE AND FUNCTION OF BACTERIA COMMUNITY AND THE COUTURE EFFECT OF RECIRCULATING AQUACULTURE SYSTEM FOR

TANG Ya-Peng1, 2, DONG Shi-Rui3, TIAN Ji-Teng1, ZHOU Qian1, 2, WANG Yin-Geng1, 2, ZHANG Tian-Shi1, 2

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 3. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

To improve the performance of recirculating aquaculture system (RAS) of, relationships between the changes of water quality indexes and the structure of bacterial community and gene function in the RAS were analyzed by ecological regulation, 16S rRNA high-throughput sequencing, metagenomic analysis, and mathematical statistics. Results show that all the water quality indexes, including temperature, dissolved oxygen, salinity, pH, ammonia nitrogen, nitrite nitrogen, and nitrate nitrogen could meet the safety requirements. After 63 days of culture, the average weight ofreached 11.78 g, the yield was 3.28 kg/m3, and the survival rate was 69.59%. The results of microbial community structure and function analysis show that there were significant differences in microbial community structure between the start-up period and the stabilized period of water quality. In the start-up period,(31.37%) was dominant, while in the stabilized period, the denitrifying bacteria including(6.65%),(6.39%),(5.21%),(3.36%),(2.30%),(1.34%),(1.42%),(1.29%), and(1.17%) took over. By comparing against the KEGG database, we found that carbohydrate metabolism and amino acid metabolism occupied the largest number of proteins in the metabolic pathway, indicating that heterotrophic denitrifiers require multiple carbon sources to perform denitrification function.

recirculating aquaculture system;; high throughput sequencing; metagenomics; microbial community structure

*國家重點研發計劃重點專項, 2019YFD0900403號; 國家重點研發計劃重點專項, 2019YFD0900104。唐亞鵬, 碩士研究生, E-mail: yapengtang@126.com

張天時, 碩士生導師, 副研究員, E-mail: zhangts@ysfri.ac.cn

2021-08-04,

2021-09-24

S967.9

10.11693/hyhz20210800175