病原微生物檢驗技術(shù)研究進展

唐尹勤

關(guān)鍵詞：病原微生物;檢驗技術(shù);綜述

【中圖分類號】Q93 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2022）08--01

一切可以導致疾病發(fā)生的病原體都稱為病原微生物，其在宿主中進行生長繁殖、釋放毒性物質(zhì)等，可引起機體不同程度的病理變化，引起感染甚至傳染病。微生物感染性疾病在臨床治療中，均需進行微生物檢驗，以明確病原微生物類型，再通過病原微生物耐藥性檢測，以便及時指導抗感染治療[1]。因此微生物檢驗技術(shù)已成為臨床治療中比較重要的工作。傳統(tǒng)的微生物檢驗法（細菌分離、培養(yǎng)及生化反應）速度比較慢，投入的人力物力比較大，難以適應診斷與治療，不能滿足臨床診斷及流行病學研究[2]。隨著免疫學、生物化學、分子生物學及計算機技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物檢驗新技術(shù)已被推廣，提高其診斷水平。本文就病原微生物檢驗技術(shù)研究進展進行綜述。

1 微生物快速檢驗技術(shù)

傳統(tǒng)微生物檢測需要細菌培養(yǎng)才能獲得結(jié)果，具有耗時、費力、操作難度高的特點，且對檢測人員的技術(shù)要求較為嚴格，稍有失誤，就會影響檢測結(jié)果的準確性。該種方法因細菌培養(yǎng)及繁殖時間較長，拉長了檢測周期，致使疾病的治療和防控工作無法滿足[3]。而微生物快速檢驗技術(shù)能夠彌補傳統(tǒng)微生物檢驗法的不足，可以提升臨床診斷的可靠性、時效性。

1.1顯色培養(yǎng)基技術(shù)

微生物在自身新陳代謝過程中產(chǎn)生的酶能夠與顯色底物發(fā)生反應，繼而顯示顏色，根據(jù)這一原理，出現(xiàn)了顯色培養(yǎng)基這一微生物快速檢驗，以完成微生物的篩選分離，主要用于金黃色葡萄球菌、霉菌、酵母菌、大腸菌群等微生物[4-5]。顯色培養(yǎng)基可使得目標微生物顯色明顯，有助于檢測人員根據(jù)顯色結(jié)果快速分析和判斷。根據(jù)顯色培養(yǎng)基的原理，經(jīng)過改進，最終成為快速檢測紙片法[6]。

1.2基因探診技術(shù)

基因探診技術(shù)又稱分子雜交技術(shù)，通過標記特定DNA片段，使得待測單鏈核酸分子與DNA分子形成雙鏈核酸分子，快速識別目標微生物。在基因探診技術(shù)的基礎(chǔ)上，形成基因芯片技術(shù)，預設DNA排列方式（微量點樣手段），在樣本分析、基因探針雜交方式，獲得微生物靶基因、含量等信息，進而快速、準確的確定病原微生物[7]。

1.3聚合酶鏈式技術(shù)

聚合酶鏈式（polymerase chain reaction，PCR）是特定條件，特定DNA片段，快速擴增處理（體外酶促反應），監(jiān)測特異性擴增產(chǎn)物，實現(xiàn)快速檢測[8]。此外在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，產(chǎn)生定時定量PCR技術(shù)、多重PCR技術(shù)、PCR變形梯度凝膠電泳技術(shù)、PCR高分辨溶解曲線分析技術(shù)等。

1.4微生物自動化鑒定技術(shù)

微生物自動化鑒定技術(shù)是一項具有自動化特征的細菌培養(yǎng)鑒定技術(shù)，主要包括全自動微生物鑒定專家系統(tǒng)、全自動血液細菌培養(yǎng)儀。全自動微生物鑒定專家系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)全自動化檢測，不僅能夠保證檢測準確性，還能夠提升檢測速度[9]。全自動血液細菌培養(yǎng)儀基本上實現(xiàn)了全過程自動化檢測，在標本收入培養(yǎng)瓶后，放入儀器，配合熒光檢測器，如此就可自動完成培養(yǎng)、動態(tài)檢測。

1.5免疫學實驗技術(shù)

免疫學實驗技術(shù)包括免疫酶技術(shù)、熒光免疫技術(shù)。免疫酶技術(shù)中運用最為廣泛的是酶聯(lián)免疫吸附試驗（enayme liked immunosorbent assay，ELISA），其主要是通過酶的催化作用轉(zhuǎn)化物質(zhì)，將酶定位標記物，觀察酶催化底物的顏色反應，得到抗原抗體反應。熒光免疫技術(shù)是利用免疫學技術(shù)結(jié)合熒光標記（熒光素視為標記物），熒光顯微鏡觀察標本，確定抗原/抗體的基本情況[10]。

2 單細胞拉曼技術(shù)

單細胞拉曼技術(shù)可用于揭示物質(zhì)本質(zhì)，基于拉曼光譜分析原理，實現(xiàn)非培養(yǎng)、無標簽、快速、高效、低成本的新方法。單細胞拉曼技術(shù)應用于病原微生物檢測中，其原理是在已建立的微生物拉曼圖譜庫基礎(chǔ)上，結(jié)合拉曼分析軟件和不同分析方法對病原微生物進行鑒定;檢測內(nèi)容包括：培養(yǎng)后鑒定細菌、真菌、分枝桿菌，直接鑒定原始樣本（透析液、尿液、血液;“指紋圖譜”行原位檢測病原微生物種類），生物膜檢測葡萄球菌，高度同源分枝桿菌鑒定（“指紋圖譜”差異峰區(qū)分）;優(yōu)勢是快速、非培養(yǎng)、無破壞性實現(xiàn)原位標本檢測和難鑒定菌株準確區(qū)分;不足是需要建立數(shù)據(jù)庫和專業(yè)分析軟件[11]。

近年來，單細胞拉曼技術(shù)朝著自動化、智能化、高通量方向發(fā)展，結(jié)合自動收集目標細胞裝置，形成單細胞拉曼分選技術(shù)平臺，應用于病原微生物自動化檢測中，其原理是將預處理樣本實現(xiàn)單個細胞流動至SRCS區(qū)（經(jīng)微流控芯片），行快速拉曼光譜檢測，分選出目標細胞（信息系統(tǒng)控制下的細胞分選系統(tǒng)），進行分子生物學檢測;具有篩選自動、高效、準確的活性細胞優(yōu)勢，但需特定的儀器和分析系統(tǒng)，且價格昂貴，檢測內(nèi)容主要包括：篩選高通量自動化目標微生物、檢測“腸道微生態(tài)”[12]。

目前大量廣譜數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)模型的建立仍需依賴專業(yè)的生物信息團隊，近年來，涌現(xiàn)出了廣譜分析軟件和數(shù)據(jù)庫，預示著智能化、便捷分析方法時代的來臨，但單細胞拉曼技術(shù)各項操作的標準有待建立，標本前期處理、參數(shù)設置的差異限制了該技術(shù)的標準化。

3 基于納米技術(shù)的病原微生物核酸快速檢測

核酸是病原微生物體內(nèi)重要的遺傳物質(zhì)，檢測核酸可快速診斷感染病原微生物類型。納米材料具有特殊的光、電、熱、磁等，結(jié)合核酸檢測技術(shù)，可提高檢測速度。

3.1基于納米孔的單分子測序技術(shù)

納米孔由生物或聚合物材料制成，納米尺寸效應在測序（核酸檢測）中發(fā)揮重要作用。納米孔技術(shù)實現(xiàn)測序的方法是：核酸分子通過納米孔時產(chǎn)生的電信號變化，是一種新型的無標記、無擴增技術(shù)，具有通量高、速度快、成本低、檢測序列長的優(yōu)點，適用于現(xiàn)場檢測。Joshua Quick[13]等使用納米孔對埃博拉病毒行DNA檢測，1小時即可完成序列測定，可在有限條件下實時監(jiān)測病毒，還可用于沙門菌、溶血性巴氏桿菌的檢測。生物納米孔的穩(wěn)定性、持久性較差，限制了納米孔的發(fā)展，而固態(tài)納米孔（納米材料：氮化硅、石墨烯）在穩(wěn)定性具有明顯優(yōu)勢，降低背景信號對檢測結(jié)果的影響。

3.2基于納米材料的核酸擴增檢測技術(shù)

3.2.1環(huán)介導等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是一種核酸擴增技術(shù)，利用聚合酶在等溫條件下擴增靶序列，放大信號，但存在結(jié)果判讀難的問題。為了解決上述問題，Orapan Manajit等[14]將金納米顆粒（AuNPs）與LAMP結(jié)合，實現(xiàn)銅綠假單胞菌的高效檢測。AuNPs與靶DNA互補雜交，抑制AuNPs因靜電作用而在鹽溶液中發(fā)生聚集現(xiàn)象，提高DNA-AuNPs的穩(wěn)定性，使溶液仍呈紅色（聚集時由紅色變?yōu)樗{色或透明），便于結(jié)果判讀。基于LAMP技術(shù)，出現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增（Reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP），用于布尼亞病毒、流感病毒等RNA檢測，但受實驗室儀器設備的限制，不適合現(xiàn)場檢測、多重復合擴增檢測。通過直接觀察待測液呈紅色，則判為陽性反應，使得RT-LAMP無需使用凝膠電泳或?qū)嵤岫葍x，即可判讀結(jié)果，實現(xiàn)現(xiàn)場檢測。

3.2.2 鏈置換擴增技術(shù)

鏈置換擴增技術(shù)（strand displacement amplification，SDA）是一種核酸等溫擴增技術(shù)，基于酶促反應，主要利用限制性內(nèi)切酶切割識別位點的核酸，聚合酶在切口處向下延伸，置換下游序列能力，擴增核酸序列（等溫條件），進行核酸檢測，但也需要特殊儀器。為了解決這一難題，Hongxing Liu等[15]將AuNPs與硫醇化后的RNA耦聯(lián)形成探診，實現(xiàn)可視化檢測，改良后的SDA技術(shù)，可檢測李斯特菌RNA，提高了傳統(tǒng)SDA的靈敏度和特異性。

3.2.3重組酶聚合酶擴增技術(shù)

重組酶聚合酶擴增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）是一種恒溫擴增新技術(shù)，由重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、鏈置換Bsu聚合酶參與，其可在較短時間和較低溫度條件下將核酸分子擴增到可檢測水平。RPA技術(shù)的產(chǎn)物主要運用側(cè)向流動技術(shù)（LF）讀取，因其標記物AuNPs具有獨特的光學性質(zhì)，標記目標容易可視化，可直接肉眼觀察，廣泛應用于微生物檢測中。但實際應用中，納米材料存在易于團聚、批間差異性大、生物安全性有待提高等問題，限制了其在核酸檢測中的應用，因此未來應加強納米材料在等溫技術(shù)中的應用，進一步優(yōu)化現(xiàn)有技術(shù)。

4 總結(jié)

近年來，病原微生物造成的感染性疾病發(fā)病率逐年升高，嚴重威脅人們的身體健康，因此對病原微生物進行早期檢測，是感染性疾病的防控關(guān)鍵。傳統(tǒng)病原微生物檢測主要包括細菌培養(yǎng)、生化鑒定等，但所需時間長，對操作人員要求高，已出現(xiàn)“窗口期”而導致假陰性結(jié)果。而微生物快速檢驗技術(shù)、單細胞拉曼技術(shù)、基于納米技術(shù)的病原微生物核酸快速檢測均可快速、準確的判定病原微生物類型，從而為感染性疾病的早期診斷和及時治療提供技術(shù)支撐。

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