板栗殼黃酮提取工藝優化及其組成分析

張家音，李浩楠，雷嗣超，趙泓濤，黃雪薇，楊芳

（武漢工程大學 環境生態與生物工程學院，湖北 武漢 430205）

板栗（Castanea mollissima Blume）為雙子葉植物，在我國分布很廣[1]，尤其在低山丘陵的緩坡和河灘地段較為多見。目前，板栗加工主要以果仁為主，其加工副產物板栗殼通常是被丟棄或者焚燒，這樣既破壞環境，又浪費資源。已有研究表明，板栗殼中含有酚類[2]、香豆素、有機酸[3]、多糖[4]、黃酮[5]、植物甾醇和鞣質[6]等多種生理活性成分，具有降血脂[7]、抗氧化[8-9]、抑菌[10]、營養保健[11]抗腫瘤活性[12]等功能。

研究表明，板栗殼黃酮含量豐富，約占6%左右[13]，具有重要的利用價值，目前，實驗室常用熱水提取法、有機溶劑提取法、堿提法、酶輔助提取法、微波輔助提法、超聲波輔助提法以及超臨界流體萃取法[14]等方法提取黃酮。熱水提取法只可提取黃酮苷類，且提取物在放置過程中容易變質；而用堿提法提取，其提取過程易受雜質影響，從而影響黃酮得率；另外，酶輔助提取法操作相對來說比較復雜；微波、超聲波輔助提取法和超臨界流體萃取法所需的實驗設備費用較高。所以，綜合考慮黃酮得率、純度以及設備條件等因素，本試驗采用醇提取法作為黃酮的提取方法[15-16]對板栗加工廢棄物中活性成分黃酮的提取工藝進行優化，為進一步研究板栗殼黃酮的組成及功能活性奠定了基礎，同時有效地避免了資源的浪費。在單因素試驗基礎上，經過響應面分析法得到板栗殼黃酮的最佳提取工藝，并采用超高效液相色譜-電噴霧電離-串聯質譜（ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry，UPLC-ESI-MS/MS）技術，對最優條件下提取的板栗殼黃酮類物質的組成進行分析，以期提高板栗殼黃酮的提取得率，并為板栗殼黃酮功能因子開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

板栗（產自山東臨沂沂蒙山）：市售；蘆丁標準品（純度98%）、亞硝酸鈉（分析純）、硝酸鋁九水合物（分析純）、乙腈（色譜純）、乙酸（色譜純）、濾膜（0.22 μm）：上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉（分析純）：鄭州派尼化學試劑廠；無水乙醇（色譜純）、甲醇（色譜純）：默克公司。

1.2 儀器與設備

FW80型高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；PL-203分析天平：梅特勒托利多儀器（上海）公司；標準檢驗篩（20目、60目）：浙江上虞市五四紗篩廠；RE-2000A旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；LGJ-10真空冷凍干燥機：北京松源華興科技發展有限公司；THZ-100恒溫培養搖床：上海一恒科學儀器有限公司；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋：北京永光明醫療儀器有限公司；SHZ-D3循環水式多用真空泵：河南省予華儀器有限責任公司；UV-1800紫外-可見分光光度計：上海翱藝儀器有限公司；XHF-DY高速分散器：寧波新芝生物科技股份有限公司；Ultimate 3000型超高效液相色譜儀：美國Dionex公司；QTRAP 6500型液相色譜質譜聯用儀、Water ACQUITY UPLC HSS T3 C18型色譜柱：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 板栗殼黃酮的提取工藝

將板栗殼去雜后用水洗凈，自然干燥至表面無水分之后放入55℃烘干箱中烘干，烘干后粉碎并過20目篩，重復粉碎直至板栗殼的大小為20目。

參考王敏等[17]、蘇云霞等[18]的研究思路和提取方法，并加以改動。將水提取液改為乙醇-水的混合提取液，恒溫水浴提取改為恒溫培養搖床提取，真空濃縮改為旋轉蒸發器濃縮，具體工藝如下：準確稱取10.00 g板栗殼粉于150 mL的錐形瓶中，加入試驗設定的相應體積分數的乙醇溶液后，于一定提取溫度的恒溫培養搖床中振蕩提取一定時間，冷卻后進行真空抽濾并在40℃條件下旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥濃縮液后得到黃酮粗提物（凍干粉）。

1.3.2 板栗殼黃酮的測定

1.3.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

參考黃雪薇等[19]的方法，以乙醇溶液為提取劑，配制濃度梯度為 0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mg/mL標準品溶液。在510 nm處測定吸光度并繪制蘆丁標準曲線，得到回歸方程為Y=11.54X-0.093 1，R2=0.999 4。

1.3.2.2 總黃酮得率的測定

根據1.3.2.1中的回歸方程，按照公式（1）計算板栗殼總黃酮得率。

式中：c為代入蘆丁標準曲線后得到的板栗殼黃酮提取物的質量濃度，mg/mL；V為待測樣體積，mL；M為板栗殼粉的質量，g；n為稀釋倍數。

1.3.3 單因素試驗

除變量外固定其他工藝條件[乙醇體積分數、液料比、提取時間及提取溫度為 70%、15∶1（mL/g）、90 min及55℃]不變的情況下，分別考察乙醇體積分數（40%、50%、60%、70%、80%）、液料比 [10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）]、提取時間（60、70、80、90、100 min）、提取溫度（50、55、60、65、70℃）對板栗殼總黃酮得率的影響。

1.3.4 響應面試驗設計

以單因素試驗為基礎，以乙醇體積分數（%）、液料比（mL/g）、提取時間（min）和提取溫度（℃）這4個對板栗殼總黃酮得率影響較大的因素為自變量，以板栗殼總黃酮得率為響應值，進行Box-Behnken試驗設計，通過響應面的結果分析得到優化的黃酮提取參數。試驗因素及水平見表1。

表1 試驗因素及水平Table 1 Test factors and levels

1.3.5 組成分析

1.3.5.1 樣品的制備

稱取1.3.1中的板栗殼黃酮粗提凍干粉0.1 g，并用70%甲醇水溶液定容至100 mL，離心后取上清，過0.22 μm 濾膜，備用。

1.3.5.2 色譜條件

色譜條件：Water ACQUITY UPLC HSS T3 C18型色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相 A 為水和0.04%的乙酸，流動相B為乙腈和0.04%的乙酸；柱溫30 ℃；進樣量 2 μL；流速 0.40 mL/min；洗脫程序為 0～11.0 min（5%A），11.0 min～12.0 min（5%A），12.0 min～12.1 min（5%～95%A），12.1 min～15.0 min（95%A）。

1.3.5.3 質譜條件

線性離子阱（linear ion trap，LIT）和三重四極桿（triple quadrupole，QQQ）掃描是在Q TRAP 6500三重四極桿-線性離子阱復合質譜系統上獲得，該系統配備了電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）渦輪增壓離子噴霧接口，測試模式為正離子模式。ESI源操作參數：電噴霧電離，溫度為500℃，噴霧電壓為5 500 V，離子源氣Ⅰ、離子源氣Ⅱ和氣簾氣分別為55、60、25 psi（1 psi=6.895 kPa）。儀器調優和質量校準分別在QQQ和LIT模式下，在10 μmol/L和100 μmol/L聚丙二醇溶液中進行。試驗使用的碰撞氣體（氮氣）設置為5 psi，進行多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）試驗得到QQQ掃描。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數對板栗殼總黃酮得率的影響

乙醇體積分數對板栗殼總黃酮得率的影響見圖1。

由圖1可以看出，當乙醇體積分數為40%～70%時，隨著乙醇體積分數的增大，板栗殼總黃酮得率逐漸上升。當乙醇體積分數達到70%時，乙醇和水的比例達到最佳，總黃酮得率達到最大；當乙醇體積分數大于70%時，板栗殼總黃酮得率降低，可能是由于其他不同結構的醇溶性（如黃酮苷元）和水溶性（如二氫黃酮及二氫黃酮醇）雜質溶出[20]，這些物質與板栗殼中待提取的黃酮競爭導致板栗殼總黃酮得率降低。所以選擇乙醇體積分數60%～80%作為響應面試驗的考察范圍。

圖1 乙醇體積分數對板栗殼總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on yield of flavonoid from chestnut shell

2.1.2 液料比對板栗殼總黃酮得率的影響

液料比對板栗殼總黃酮得率的影響見圖2。

圖2 液料比對板栗殼總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on yield of flavonoid from chestnut shell

由圖 2 可以看出，液料比在 10∶1（mL/g）～15∶1（mL/g）范圍內，隨液料比增大，總黃酮得率大幅度升高，可能是因為適當的液料比加快了黃酮類物質的溶解[21]；當液料比在15∶1（mL/g）時總黃酮得率達最高；但液料比繼續增加時，因為提取液過多，而黃酮含量幾乎不變，整體出現總黃酮得率降低趨勢，且在工業上液料比過高存在不易濃縮、溶劑消耗量大的問題。所以將液料比定在 10∶1（mL/g）～20∶1（mL/g）作為響應面的考察范圍。

2.1.3 提取時間對板栗殼總黃酮得率的影響

提取時間對板栗殼總黃酮得率的影響見圖3。

圖3 提取時間對板栗殼總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of flavonoid from chestnut shell

由圖3可以看出，提取時間的增加使得板栗殼總黃酮得率呈波動變化，兩個峰值分別出現在70 min和90 min處。總體上來說，在60 min～100 min內，黃酮提取率在5.2%～5.6%之間變化，差別并不明顯，并且在平行試驗間存在一定的差別。而隨著提取時間的增長，其他能夠溶于乙醇和水的雜質也逐漸溶出，從而抑制了板栗殼黃酮類物質的溶出，同時考慮到黃酮類物質存在著水解的現象，有的黃酮水解只需要數分鐘，有的則需很長時間，且在工業上提取時間越長經濟支出越高，因此在相同總黃酮得率的情況下，提取時間不宜過長。因此，將提取時間60 min～80 min作為響應面試驗的考察范圍。

2.1.4 提取溫度對板栗殼總黃酮得率的影響

提取溫度對板栗殼總黃酮得率的影響見圖4。

圖4 提取溫度對板栗殼總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on yield of flavonoid from chestnut shell

由圖4可以看出，提取溫度為50℃～65℃時，總黃酮得率整體呈上升趨勢。原因可能是提取溫度升高分子的擴散運動加快，進而加速了黃酮類物質的溶出[22]。65℃時總黃酮得率達到最高，而提取溫度超過65℃時，過高溫度，加快其他醇溶性物質的溶出，干擾黃酮在乙醇溶液中的溶出或者是因為溫度過高破壞了黃酮類物質的穩定性[23]，從而導致總黃酮得率的降低。故選擇提取溫度60℃～70℃作為響應面試驗的考察范圍。

2.2 響應面法優化板栗殼總黃酮的提取工藝

2.2.1 響應面試驗設計及結果

Box-Behnken試驗設計及結果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experimental

經回歸擬合分析，得到的回歸方程：R=6.08-0.5258A+0.139 2B-0.037 5C+0.074 2D-0.345 0AB-0.035 0AC-0.052 5AD+0.042 5BC+0.060 0BD+0.150 0CD-1.02A2-0.440 6B2-0.288 1C2-0.203 1D2。

方差分析結果如表3所示。

表3 方差分析結果Table 3 Results of analysis variance

各因素對黃酮提取率的影響可以通過F值判定，F值越大，其影響越強；P值為該模型與試驗各個考察因素的顯著程度。表3中模型的F值為14.30，且失擬項P>0.05，差異不顯著，具有統計學意義，相關系數R2=0.934 6，表明此方程可以充分的擬合數據，因此板栗殼黃酮提取的最佳工藝條件可以由該模型進行分析。表3中乙醇體積分數A影響極顯著（P<0.001），其余一次項B、C、D影響均不顯著（P>0.05）；在交互因素中AB的影響為顯著（P<0.05）；在二次項中A2、B2影響極顯著（P<0.001），C2影響是高度顯著（P<0.01），D2影響顯著（P<0.05）。4個影響因素按影響效果大小排列：乙醇體積分數>液料比>提取時間>提取溫度。

2.2.2 響應面各因素間的交互分析

響應面圖是試驗中各因素交互作用的響應值得到的3D曲面圖，試驗的響應值及各因素之間的影響作用可由圖分析。從等高線圖和3D圖中可以直觀地看出兩因素對總黃酮得率影響的交互程度，等高線圖為橢圓表示相互作用顯著，圓形則表示不顯著；3D曲面圖的爬坡越陡表示兩個因素的相互作用越顯著，反之則不顯著。用Design-Expert 11軟件處理得到板栗殼黃酮類物質提取的等高線和3D響應面見圖5～圖10。

圖5 乙醇體積分數與液料比的交互作用Fig.5 Interaction between ethanol concentration and liquid-solid ratio

圖6 乙醇體積分數與提取溫度的交互作用Fig.6 Interaction between ethanol concentration and extraction temperature

圖7 乙醇體積分數與提取時間的交互作用Fig.7 Interaction between ethanol concentration and extraction time

圖8 液料比與提取溫度的交互作用Fig.8 Interaction between liquid-solid ratio and extraction temperature

圖9 液料比與提取時間的交互作用Fig.9 Interaction between liquid-solid ratio and extraction time

圖10 提取時間與提取溫度的交互作用Fig.10 Interaction between extraction time and temperature

從圖5可以看出，乙醇體積分數和液料比這兩個因素交互形成的響應面凸出陡峭且等高線圖為橢圓形，說明這兩個考察因素間的相互作用能夠顯著影響板栗殼總黃酮的得率，這符合表3的結果。從圖6可以看出，當乙醇體積分數固定為一定值時，板栗殼總黃酮得率開始時隨著提取溫度的升高而增大，到達一定值時，其得率隨著提取溫度的升高而減小。當提取溫度固定為一定值時，板栗殼總黃酮得率隨著乙醇體積分數的增大呈現先增大后減小的趨勢，但是總體變化趨勢較小。從圖7可以看出，當乙醇體積分數固定為一定值時，板栗殼總黃酮得率開始時隨著提取時間的升高而增大，到達一定值時，其得率隨著提取時間的升高而減小。當提取時間固定為一定值時，板栗殼總黃酮得率隨著乙醇體積分數的增大呈現先增大后減小的趨勢，但是總體變化趨勢較為平緩。結合圖8～圖10和表3，響應面圖凸出不明顯且等高線圖趨于圓形，說明各組兩因素的相互作用不能夠顯著影響板栗殼總黃酮的得率。

2.2.3 最優工藝驗證

通過Design-Expert 11軟件擬合的結果得到了板栗殼總黃酮得率的最大理論值為6.27%。經計算得出該條件下提取板栗殼黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分數 66.86%，液料比 17.08∶1（mL/g），提取溫度65.12℃，提取時間71.98 min。由于實際的操作限制，調整乙醇體積分數、液料比、提取溫度以及提取時間分別為 70%、17∶1（mL/g）、65 ℃以及 70 min，在此提取工藝條件下，重復試驗5次，得到板栗殼總黃酮得率的平均值為6.14%，接近理論值，說明采用響應面優化分析所得的模型具有可靠性。

2.3 組成分析

板栗殼黃酮組成分析結果見表4（按照含量從高到低排列）。

表4 板栗殼黃酮組成Table 4 Composition of flavonoids from chestnut shell

本試驗采用UPLC-ESI-MS/MS技術對板栗殼黃酮的組成進行分析，在正離子模式下，黃酮類化合物的分離度和離子化的效果都較好，共鑒別出37種純度較高的黃酮。其中6，7，8-三羥基-5-甲氧基黃酮含量最高，其次為香葉木素。

3 結論

本研究以乙醇溶液為提取劑，經過響應面優化得到板栗殼黃酮提取最佳工藝參數：乙醇體積分數70%，液料比 17∶1（mL/g），提取溫度 65 ℃，提取時間70 min，此時，總黃酮得率達到6.14%。影響板栗殼總黃酮得率的因素按從大到小排列：乙醇體積分數>液料比>提取時間>提取溫度。采用UPLC-ESI-MS/MS技術分析板栗殼中黃酮類化合物共有37種，其中6，7，8-三羥基-5-甲氧基黃酮的含量最高，其次為香葉木素。