響應面法優化花椒葉多酚提取工藝及其抗氧化活性

高岳，尹帥，袁孝瑞，劉玉，袁一博，趙圣明*

（1.蘇州農業職業技術學院 食品科技學院，江蘇 蘇州 215008；2.河南科技學院 食品學院，河南 新鄉 453003）

花椒屬于蕓香科植物，花椒葉多呈卵形和稀披針形，喜愛溫暖濕潤的環境，耐嚴寒，抗干旱，抗病性強。全球約有250種花椒，廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區。在我國，花椒主要分布在山東、河南、河北、四川、陜西和長江以南地區[1]。花椒作為一種食品調味料，被譽為“八大調味品”之一，同時又是傳統中藥，常被用作食品添加劑和藥物[2-3]。花椒富含生物堿、揮發油、脂肪酸、香豆素、酰胺和三萜類等生物活性物質[4]。生物堿具有抑菌、抗腫瘤、抑制血小板凝集等生理功能[5]；揮發油具有抑菌殺蟲、抗氧化等功效[6]。花椒葉和果皮中提取出的香精油可作為植物殺蟲劑或驅避劑用于倉庫、糧庫害蟲防治[7]。花椒籽蛋白抗菌肽對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等食品中常見有害細菌均有一定抑制作用，且對冷熱加工食品均能起到抑菌作用[8]。

植物多酚屬于植物次級代謝產物，主要包括花青素、單寧、黃酮、酚酸等活性成分[9]。目前關于植物多酚抗氧化活性的研究較多。張玉娟[10]采用分離純化技術對花椒葉抗氧化成分進行靶標分離和結構鑒定，明確了花椒葉抗氧化活性基團，并發現黃酮類化合物中抗氧化活性最強的是乙酸乙酯組分和丙酮組分的酚類成分，通過分析活性組分確定花椒葉所含抗氧化物質主要是綠原酸、表兒茶素、蘆丁和金絲桃苷等，效果最佳的成分是金絲桃苷和槲皮苷；Sun等[11]測定10種不同品種花椒葉主要黃酮類化合物含量，發現花椒葉主要含金絲桃苷和槲皮苷；范菁華[12]采用超聲波輔助提取花椒葉中總黃酮并研究其體外抗氧化活性，發現D4020型樹脂純化的花椒葉總黃酮清除DPPH自由基的效果遠優于VC；李君珂等[13]研究發現在白鰱咸魚加工過程中加入花椒葉多酚可顯著降低魚脂肪氧化程度。響應面法優化已應用于草莓多酚、香水蓮花多酚、無花果干等植物多酚的提取[14-16]，但目前有關花椒葉多酚的提取工藝優化研究較少。本研究采用響應面法優化正丁醇對花椒葉多酚的提取工藝并對其抗氧化活性進行測定，旨在為有效開發花椒葉提供相關工藝技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮花椒葉：采自新鄉南太行山區；福林酚試劑：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸、碳酸鈉：北京奧博星生物技術有限責任公司；正丁醇：湖南匯虹試劑有限公司；乙醇、硫酸亞鐵、雙氧水：南京化學試劑有限公司；水楊酸：天津市科密歐化學試劑有限公司；2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：上海阿拉丁生化科技有限公司。以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-S4型恒溫水浴鍋：廣州一馬環保科技有限公司；FW100高速萬能粉碎機、WGL-125B電熱鼓風干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司；WFJ7200型可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；MC210S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；SHB-III循環水式真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；RE-2A旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 花椒葉多酚提取方法

將新鮮花椒葉清洗干凈去除雜質，置于干燥箱中烘干，利用粉碎機粉碎，過20目篩；每個處理組取1.0 g花椒葉粉末用50 mL正丁醇浸提，并抽濾收集各提取液，定容至50 mL備用。

1.4 標準曲線繪制

參考熊汝琴等[17]測定青花椒總酚含量的方法，準確稱量0.1 g沒食子酸溶解于蒸餾水，定容至100 mL得到質量濃度為1.0 mg/mL的沒食子酸溶液，分別取不同體積沒食子酸溶液于50 mL容量瓶定容，再取各不同濃度的沒食子酸溶液2 mL，加入2 mL福林酚試劑搖勻，靜置5 min，加入4 mL體積分數10%的碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容，用可見分光光度計測定波長765 nm下各標準液吸光度，并繪制標準曲線，得到線性回歸方程：y=0.587x-0.026，R2=0.998 6，y 表示吸光度，x表示沒食子酸質量濃度（mg/mL）。

1.5 樣品多酚含量的測定

吸取0.1 mL多酚提取液按照1.4方法進行顯色反應，測定吸光度，利用回歸方程求出提取液中多酚含量，利用下式計算樣品多酚含量。

式中：Y為樣品多酚含量，mg/g；C為提取液多酚濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；X為樣品稀釋倍數；M為樣品取樣量，g。

式中：M1為多酚質量，g；M2為花椒葉樣品質量，g。

1.6 單因素試驗

以花椒葉多酚提取率為因變量，分別以料液比、提取溫度、提取時間作為考察因素，探究各單因素對花椒葉多酚提取率的影響。

1.6.1 不同提取溫度對花椒葉多酚提取率的影響

準確稱量1.0 g花椒葉粉末6份分別置于6個錐形瓶內，并加入50 mL體積分數65%的正丁醇，分別在 40、50、60、70、80、90 ℃下恒溫水浴提取 1 h，抽濾收集提取液并定容至50 mL，測量多酚含量，計算多酚提取率。

1.6.2 不同料液比對花椒葉多酚提取率的影響

準確稱量1.0g花椒葉粉末6份分別置于6個錐形瓶內，分別以料液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）于80℃水浴提取1h，抽濾收集提取液并定容至50mL，測量多酚含量，計算多酚提取率。

1.6.3 不同提取時間對花椒葉多酚提取率的影響

準確稱量1.0 g花椒葉粉末6份分別置于6個錐形瓶內，并加入50 mL體積分數為65%的正丁醇，在50℃條件下對 6 份樣品分別提取 20、40、60、80、100、120 min，抽濾收集提取液并定容至50 mL，測量多酚含量，計算多酚提取率。

1.7 花椒葉多酚提取工藝響應面優化方法

在單因素試驗結果基礎上，以花椒葉多酚提取率為響應值，進行三因素三水平響應面試驗，因素與水平見表1。

表1 試驗因素水平Table 1 Factors and levels of test

1.8 抗氧化活性測定

1.8.1 DPPH自由基清除能力測定

參考王萍等[18]的方法并作修改，稱取250 mg的DPPH溶于乙醇，置于250mL容量瓶定容，搖勻靜置得到濃度為1 mg/mL的DPPH溶液。取3 mL提取液和3 mL DPPH溶液置于同一比色管混勻，避光靜置30 min，以70%乙醇溶液為空白樣，在波長517 nm處測得吸光度A1；再分別取3 mL提取液和3 mL 70%乙醇溶液、3 mL DPPH溶液和3 mL 70%乙醇溶液混勻，避光靜置30 min，在波長517 nm處分別測得吸光度A2、A3，用下式計算DPPH自由基清除率。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A3]×100

1.8.2 羥自由基清除能力測定

參考趙楠楠等[19]的方法并作改進，取2 mL提取液于試管中，向試管中加入2 mL FeSO4溶液和2 mL H2O2溶液后振蕩搖勻靜置10 min，再加入2 mL水楊酸（以50%乙醇溶液為溶劑），靜置0.5 h，在510 nm波長處測吸光度，記為A1；并用等體積水代替多酚樣液作空白試驗測吸光度，記為A2；用等體積水代替水楊酸作對照組測吸光度，記為A3。試驗進行3次取平均值，羥自由基清除率計算公式如下。

羥自由基清除率/%=[1-（A1-A3）/A2]×100

1.8.3 ABTS+自由基清除能力測定

參考顏征等[20]的方法，首先配制ABTS溶液，使用7 mmol/L ABTS溶液和4.9 mmol/L過硫酸鉀溶液以體積比1∶1混勻，避光靜置12 h即得ABTS儲備液，取提取液各2 mL加入4 mL的ABTS溶液振蕩搖勻，25℃條件下避光充分反應5 min，在734 nm處測樣液吸光度，記為A1；取2 mL 95%乙醇和4 mL ABTS溶液在734nm處測對照組溶液吸光度，記為A2；標準管取2mL多酚樣液加入4 mL 95%乙醇溶液，波長734 nm處測吸光度，記為A3。試驗進行3次取平均值，用下式計算ABTS+自由基清除率。

ABTS+自由基清除率/%=[1-（A1-A3）/A2]×100

1.9 數據處理

采用SPSS 24.0軟件進行數據分析，并用Origin 2017軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 花椒葉多酚提取的單因素試驗

2.1.1 不同提取溫度對花椒葉多酚提取率的影響

提取溫度對花椒葉多酚提取率的影響見圖1。

圖1 提取溫度對花椒葉多酚提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum leaf

如圖1所示，花椒葉多酚的提取率隨著提取溫度的升高而逐漸增大，在90℃時提取率達到最大，為4.5%，可能是較高的提取溫度促使分子運動速率加快，利于多酚物質溶出。在40℃～80℃溫度范圍內，花椒葉多酚提取率隨提取溫度升高呈顯著上升趨勢；80、90℃時多酚提取率沒有顯著性差異。綜上，選擇提取溫度為70、80、90℃進行后續優化試驗。

2.1.2 不同料液比對花椒葉多酚提取率的影響

料液比對花椒葉多酚提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對花椒葉多酚提取率的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on the yield of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum leaf

由圖2可看出，花椒葉多酚提取率隨著溶劑體積的增加而逐漸增大，在料液比為1∶60（g/mL）時，多酚提取率達到最大值（4.2%）。料液比在 1∶10（g/mL）～1∶50（g/mL）時，隨著溶劑體積增大多酚提取率顯著上升，料液比為 1∶50、1∶60（g/mL）時多酚提取率沒有顯著性差異。綜上，選擇料液比為 1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）進行后續優化試驗。

2.1.3 不同提取時間對花椒葉多酚提取率的影響

提取時間對花椒葉多酚提取率的影響見圖3。

圖3 提取時間對花椒葉多酚提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum leaf

由圖3可知，花椒葉多酚提取率隨著提取時間的延長呈現先顯著增大后緩慢減小的趨勢，當提取時間為100 min時多酚提取率最大，為4.4%，提取時間超過100 min后多酚的提取率變化不顯著。因此選擇提取時間80、100、120 min進行后續優化試驗。

2.2 響應面結果分析

2.2.1 回歸方程的建立及方差分析

響應面試驗設計與結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface methodology

使用Design-Expert 8.0軟件對表2結果進行多元回歸擬合得到花椒葉多酚提取率（Y）與料液比（X1）、提取溫度（X2）、提取時間（X3）之間的回歸方程為Y=4.67+0.039X1+0.023X2+0.024X3-0.015X1X2-0.012X1X3+0.015X2X3-0.050X12-0.087X22-0.020X32。

模型方差分析結果如表3所示。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

模型F值57.57，P<0.000 1達到了極顯著水平，說明該模型具有極顯著性；失擬項P=0.144 4>0.05，不顯著，表明模型擬合度良好，誤差較小。模型相關系數R2=0.986 7，R2Adj=0.969 5，表明使用該模型所得預測值與實際測得值相關性良好，可對花椒葉多酚提取率進行預測。由F值和P值可發現料液比、提取溫度、提取時間均對多酚提取率有極顯著影響，影響大小依次是料液比>提取時間>提取溫度。

2.2.2 各因素交互作用

各因素交互作用的響應面圖見圖4。

圖4 各因素交互作用Fig.4 Interactive effects of various parameters

曲面圖可直觀反映各因素對多酚提取率的影響程度，曲面圖越陡峭說明影響越大，相反，越平緩說明影響越弱。由圖4可以看出，料液比與提取溫度、提取溫度和提取時間之間的響應面較陡峭，等高線呈橢圓形，交互作用顯著，與表3方差分析結果一致。

2.2.3 響應面最優條件驗證

通過Design-Expert 8.0軟件得出花椒葉多酚最佳提取工藝條件為料液比1∶56.08（g/mL）、提取溫度80.85℃、提取時間106.96 min，預測多酚提取率為4.68%。為了驗證模型的可靠性，采用優化的最佳工藝條件進行驗證試驗，考慮到實際操作可行性，將工藝參數調整為料液比1∶56（g/mL）、提取溫度81℃、提取時間107 min。重復3次取平均值，得到花椒葉多酚提取率為4.63%，這與模型預測的理論值接近。因此，響應面法得到的花椒葉多酚提取工藝參數真實可靠，該模型具有實際應用價值。

2.3 花椒葉多酚抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力

花椒葉多酚和VC對DPPH自由基清除率的影響如圖5所示。

圖5 花椒葉多酚和VC對DPPH自由基的清除能力Fig.5 DPPH free radical scavenging capacity of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum leaf and VC

由圖5可知，隨著多酚濃度的升高其對DPPH自由基的清除能力逐漸增強，當多酚濃度為1.0 mg/mL時DPPH自由基清除率可高達93.27%，與1.0 mg/mL VC對DPPH自由基的清除能力相當，說明花椒葉多酚對DPPH自由基有較好的清除能力。

2.3.2 羥自由基的清除能力

花椒葉多酚對羥自由基清除率的影響如圖6所示。

由圖6可以看出，與同濃度的VC相比，花椒葉多酚對羥自由基清除能力較弱，但其仍有一定的清除能力。花椒葉多酚對羥自由基的清除能力隨著多酚濃度的升高呈現增高的趨勢，在濃度為1.0 mg/mL時羥自由基清除率達到最高值（82.22%）。濃度高于0.6 mg/mL后，花椒葉多酚的羥自由基清除率隨多酚濃度變化趨于平緩。

圖6 花椒葉多酚和VC對羥自由基的清除能力Fig.6 Hydroxy free radical scavenging capacity of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum leaf and VC

2.3.3 ABTS+自由基清除能力

花椒葉多酚和VC對ABTS+自由基清除率的影響如圖7所示。

圖7 花椒葉多酚和VC對ABTS+自由基的清除能力Fig.7 ABTS+free radical scavenging capacity of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum leaf and VC

由圖7可知，與同濃度的VC相比，花椒葉多酚對ABTS+自由基清除能力較弱，但其仍有一定的清除能力。隨著多酚濃度升高，花椒葉多酚對ABTS+自由基清除率也相應升高，多酚濃度低于0.8 mg/mL時ABTS+自由基清除率隨濃度升高呈快速增大的趨勢。花椒葉多酚對ABTS+自由基的清除作用間接表明花椒葉多酚具有良好的抗氧化功效。

3 結論

本研究分別考察了料液比、提取溫度、提取時間3個因素對花椒葉多酚提取率的影響，并通過響應面法進行優化最終確定花椒葉多酚提取的最佳工藝條件為提取時間 107 min、提取溫度 81 ℃、料液比 1∶56（g/mL）。在最優的工藝條件下，花椒葉多酚提取率為4.63%。抗氧化研究結果顯示花椒葉多酚對DPPH自由基、羥自由基和ABTS+自由基均具有良好的清除能力。