不同提取方法對青錢柳葉不溶性膳食纖維理化性質和抗氧化活性的影響

林偉達，李娜，祝子坪，李鈞敏*

（1.臺州科技職業學院，浙江 臺州 318020；2.臺州學院 浙江省植物進化生態學與保護重點實驗室，浙江 臺州 318000）

膳食纖維（dietary fiber，DF）是指一類不能被人體消化酶消化，主要由可食性植物細胞壁殘余物（纖維素、半纖維素、木質素等）及與之締合的相關物質組成的化合物，被稱為繼淀粉、蛋白質、脂肪、維生素、礦物質和水之后的“第七營養素”[1]。根據是否溶于水可將膳食纖維分為可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）。其中，IDF具有高持水力、溶脹率和持油力，能夠有效增大糞便體積，促進胃腸道蠕動，具有預防便秘、結腸癌、II型糖尿病和心血管疾病等作用，還具有較高的陽離子交換能力，表現出良好的解毒效果[2]。目前IDF廣泛應用于烘焙食品中，可以有效提高面制品的營養價值，改善其結構品質；還可作為脂肪替代品應用于肉制品，提高肉制品的持水能力、持油能力和流變學特性[3]。

目前從植物中提取IDF的方法主要有酸堿法、微波輔助法、超聲輔助法、酶法等。IDF的品質與其理化性質和生理功能相關，不同的制備工藝會影響IDF的理化性質，從而影響其發揮相應生理功能。

青錢柳[Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinskaja]，又名搖錢樹、山溝樹、麻柳、青錢李等，系胡桃科青錢柳屬植物。青錢柳葉片具有多種對人體健康有益的生理和藥理活性成分，在2013年被國家衛生和計劃生育委員會批準為新資源食品[4]。青錢柳葉片提取物在降血糖、降血脂、降血壓和抗炎等方面所具備的生理活性受到了國內外的廣泛關注[5]。在工業生產上，青錢柳葉片提取多糖后的殘渣，常被作為廢棄物丟棄。張凱江[6]利用熱水浸提法提取水溶性多糖，采用微波干燥技術從平菇渣粉中提取IDF。而關于利用青錢柳葉片提取多糖后的殘渣提取IDF，未見相關文獻報道。

本研究以青錢柳葉片提取多糖之后的殘渣為原料，分別采用酸堿法、雙酶法、微波輔助法、超聲輔助堿法、超聲輔助酶法制備IDF，對5種方法提取的IDF的紅外光譜進行比較，并對其理化性質和抗氧化活性進行研究。以期為青錢柳葉膳食纖維功能性食品的開發，以及青錢柳葉片殘渣的充分利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

青錢柳葉片殘渣：由臺州學院浙江省植物進化生態學與保護重點實驗室采用超聲逆流三級提取罐中試生產青錢柳葉片水溶性多糖后的殘渣，殘渣于70℃干燥箱中烘干，過40目篩備用。

α-淀粉酶（4 000 U/mL）：上海麥克林生化科技有限公司；木瓜蛋白酶（4 000 U/mL）：上海生工生物工程有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海藍季科技發展有限公司；鄰二氮菲、三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；維生素C：上海潤捷化學試劑有限公司；鹽酸：浙江漢諾化工科技有限公司；醋酸鈉、無水乙醇：上海化學試劑總廠；磷酸氫二鈉：上海展云化工有限公司；磷酸二氫鈉、三氯化鐵：宜興市展望化工試劑廠；醋酸：浙江中星化工試劑有限公司；過氧化氫、硫酸亞鐵、氫氧化鈉：國藥集團化學試劑有限公司。以上化學試劑均為分析純。

1.2 試驗儀器

DHG-92404S型電子恒溫鼓風干燥箱、JN-3200DT型超聲清洗儀：寧波江南儀器廠；FA2004A型電子分析天平：上海精天電子儀器有限公司；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；HI-2221型pH計：哈納沃德儀器（北京）有限公司；M1-L213B微波爐：廣東美的廚房電器制造有限公司；LD5-2B型臺式離心機：北京京立離心機有限公司；SHB-ⅢA型循環水式真空泵：臨海市譚氏真空設備有限公司；ReadMax 1900型光吸收全波長酶標儀：上海閃譜生物科技有限公司；Nicolet iS10型傅立葉變換紅外光譜儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 青錢柳葉片殘渣不溶性膳食纖維的制備

1.3.1.1 酸堿法

參照蔣緯等[7]的方法并略作修改。稱取20 g原料按照料液比1∶20（g/mL）加入蒸餾水，用濃度為1 mol/L的HCl溶液調節pH值至1.0，于80℃恒溫水浴鍋中水解 90 min，抽濾，濾渣按照料液比 1∶20（g/mL）加入質量分數為1.4%的NaOH溶液，于75℃恒溫水浴鍋中堿解80 min，抽濾，濾渣于70℃干燥至恒重得到IDF。

1.3.1.2 雙酶法

參照蔣緯等[7]的方法并略作修改。稱取20 g原料按照料液比1∶20（g/mL）加入蒸餾水，用濃度為1.0 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液調節pH值為6.0，加入400μL α-淀粉酶溶液，于60℃酶解35 min，然后100℃滅酶活10 min后冷卻，再調節pH值為6.0，加入400 μL木瓜蛋白酶溶液，于40℃酶解35 min，然后100℃滅酶活10 min，抽濾，濾渣于70℃干燥至恒重得到IDF。

1.3.1.3 微波輔助法

參照牟建樓等[8]的方法并略作修改。稱取20g原料按照料液比1∶20（g/mL）加入蒸餾水，用濃度為1.0mol/L的HCl溶液和NaOH溶液調節pH值為6.0，微波火力為高火，微波時間10 min，抽濾，濾渣于70℃干燥至恒重得到IDF。

1.3.1.4 超聲輔助堿法

參照蔣緯等[7]的方法并略作修改。稱取20 g原料按照料液比1∶20（g/mL）加入質量分數為4%的NaOH溶液，在超聲功率120 W、超聲溫度55℃條件下處理80 min，抽濾，濾渣于70℃干燥至恒重得到IDF。

1.3.1.5 超聲輔助酶法

參照蔣緯等[7]的方法并略作修改。稱取20 g原料按照料液比1∶20（g/mL）加入蒸餾水，用濃度為1.0 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液調節pH值為6.0，加入200μL木瓜蛋白酶溶液，在超聲溫度40℃、超聲功率120 W條件下酶解35 min，然后升溫至100℃滅酶活10 min，抽濾，濾渣于70℃干燥至恒重得到IDF。

1.3.2 紅外光譜分析

稱取干燥至恒重的不同方法提取的IDF樣品2mg，與KBr混合研磨后壓片，用傅立葉變換紅外光譜儀在400 cm-1～4 000 cm-1范圍內進行掃描，對其構型進行初步分析。

1.3.3 理化性質測定

持水力與膨脹率的測定參照朱妞等[9]的方法，持油力測定參照鄭剛等[10]的方法。

1.3.4 抗氧化活性測定

參照周小理等[11]的方法并略作修改。稱取不同方法提取的青錢柳葉片殘渣IDF各2 g，按照料液比1∶50（g/mL）加入70%乙醇溶液，于70℃恒溫水浴鍋中浸提5 h，4 000 r/min離心20 min，取上清液作為樣品液備用。

1.3.4.1 DPPH自由基清除率測定

參照謝建華[12]的方法并略作修改。吸取0.5 mL樣品液于玻璃試管中，加入0.5 mL DPPH溶液（無水乙醇配制，0.1 mmol/L）快速振蕩，使混合液充分混勻，在室溫25℃下避光放置30 min后，于517 nm測定吸光值。DPPH自由基清除率按以下公式計算。

式中：A0為0.5 mL DPPH溶液與0.5 mL水的吸光值；A1為0.5mL無水乙醇與0.5mL樣品溶液的吸光值；A2為0.5 mL DPPH溶液與0.5 mL樣品溶液的吸光值。

1.3.4.2 羥基自由基清除率測定

參照謝建華[12]的方法并略作修改。取0.2 mL磷酸鹽緩沖溶液（50 mmol/L，pH7.4），加入 0.15 mL 鄰二氮菲溶液（5 mmol/L），振蕩混勻，加入 0.1 mL FeSO4溶液（7.5 mmol/L），然后加入0.1 mL樣品液，振蕩混勻，加入0.1%H2O2溶液0.1 mL，最后加入0.35 mL蒸餾水，記為樣品組。空白組以0.1 mL蒸餾水代替樣品液；對照組以0.2 mL蒸餾水代替樣品液和H2O2溶液。37℃恒溫水浴反應1 h后，于536 nm測定吸光值。羥基自由基清除率按下列公式計算。

式中：A0為對照組吸光值；A1為空白組吸光值；A2為樣品組吸光值。

1.3.4.3 鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）測定

參照謝建華[12]的方法并略作修改。工作液的配制：由10 mmol/L TPTZ溶液（40 mmol/L鹽酸溶液配制），20 mmol/L的三氯化鐵溶液和300 mmol/L pH3.6的醋酸鹽緩沖液以1∶1∶10（體積比）組成，使用前混合均勻。

以 VC為標準品，配制不同濃度（0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL）的 VC系列標準溶液，吸取各濃度標準溶液0.1 mL于試管中，然后加入0.4 mL超純水和0.5 mL FRAP工作液，振蕩混勻，37℃恒溫水浴10 min，于593 nm測定吸光值，以超純水作空白對照。以VC濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標作標準曲線。樣品液采用上述同樣的方法測定鐵離子還原/抗氧化能力。由標準曲線計算獲得的VC濃度（μg/mL）作為FRAP值，表示為μg VC當量/mL。

1.4 統計分析

所有數據平行測定3次，采用Origin 2019軟件作圖，應用SPSS 17.0軟件對數據進行方差分析，差異顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 傅立葉紅外光譜分析

5種不同方法提取的不溶性膳食纖維樣品的紅外光譜如圖1所示。

圖1 不同方法提取的不溶性膳食纖維的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of IDF extracted by different methods

由圖1可知，5種方法提取的IDF均具有纖維素類多糖的特征吸收峰。3 277 cm-1～3 372 cm-1處吸收峰為O-H或N-H的伸縮振動，2 920 cm-1～2 934 cm-1處吸收峰為C-H的伸縮振動，1 643 cm-1～1 661 cm-1處為與芳香環相關的吸收峰，是木質素的特征吸收峰[13]。1 033 cm-1～1 063 cm-1處吸收峰是由纖維素和半纖維素中C-O收縮振動產生的[14]，881 cm-1～902 cm-1處吸收峰為β-吡喃糖C-H變角振動的特征吸收峰[15]。綜上所述，不同方法提取的IDF的紅外光譜峰形相似，表明其結構基本一致，只是在吸收強度上存在差異。

2.2 理化性質

2.2.1 膨脹率

膳食纖維吸水后體積膨大，對人體胃腸道產生容積作用，易引起飽腹感，同時還會影響胃腸道對食物中其他成分的吸收，可以有效預防肥胖[10]。膳食纖維吸水膨脹后，在腸道中可增大糞便的體積，能夠促進腸道蠕動[3]。不同方法提取的不溶性膳食纖維的膨脹率見圖2。

由圖2可知，酸堿法（2.97 mL/g）和超聲輔助堿法（2.63 mL/g）提取的IDF膨脹率顯著高于微波輔助法（1.33 mL/g）、雙酶法（1.66 mL/g）和超聲輔助酶法（1.16 mL/g）。

2.2.2 持水力

膳食纖維中含有大量親水基團，可以減少膳食纖維的脫水和收縮，還可以幫助人體減輕泌尿系統的壓力，更快地排出毒素[16]。不同方法提取的不溶性膳食纖維的持水力見圖3。

圖3 不同方法提取的不溶性膳食纖維的持水力Fig.3 Water holding capacity of IDF extracted by different methods

由圖3可知，超聲輔助堿法提取的IDF持水力顯著高于其它4種方法提取的IDF。堿處理會破壞（半）纖維素內的氫鍵，使膳食纖維結構內的更多親水基團暴露出來，并使膳食纖維的內部結構疏松[17]，這導致超聲輔助堿法提取的IDF持水力較大。而酸堿法提取的IDF可能由于酸或堿處理強度過高導致結構變化嚴重，持水力比超聲輔助堿法降低。

2.2.3 持油力

膳食纖維能夠在腸道中形成網狀結構，其具有物理吸附功能，能夠吸附脂肪和膽固醇等物質[3]。不同方法提取的不溶性膳食纖維的持油力見圖4。

圖4 不同方法提取的不溶性膳食纖維的持油力Fig.4 Oil holding capacity of IDF extracted by different methods

由圖4可知，超聲輔助堿法提取的IDF持油力（1.38 g/g）顯著高于其它4種方法提取的IDF。酸堿處理會導致膳食纖維表面凹凸不平，且尖峰、溝壑和空隙多[18]，這可能導致超聲輔助堿法提取的IDF持油力較大。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除率

不同方法提取的IDF的DPPH自由基清除率如圖5所示。

圖5 不同方法提取的不溶性膳食纖維的DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH free radical scavenging rate of IDF extracted by different methods

由圖5可知，微波輔助法提取的IDF的DPPH自由基清除率最高（93.2%），顯著高于酸堿法（26.3%）、超聲輔助堿法（31.1%）和雙酶法（83%）。超聲輔助酶法提取的IDF的DPPH自由基清除率次之，為89.2%，與微波輔助法提取的IDF并無顯著性差異。

2.3.2 羥基自由基清除率

不同方法提取的IDF的羥基自由基清除率如圖6所示。

圖6 不同方法提取的不溶性膳食纖維的羥基自由基清除率Fig.6 Hydroxyl radicals scavenging rate of IDF extracted by different methods

由圖6可知，雙酶法提取的IDF表現出最高的羥基自由基清除率（12.6%），顯著高于酸堿法（5.2%）和超聲輔助堿法（0.3%），而微波輔助法（11.2%）、超聲輔助酶法（10.2%）和雙酶法提取的IDF羥基自由基清除率并無顯著性差異。酸堿法和超聲輔助堿法提取的IDF羥基自由基清除率低于其它3種方法，可推測膳食纖維經堿性條件處理之后，其羥基自由基清除能力會減弱。

2.3.3 鐵離子還原/抗氧化能力

鐵離子還原/抗氧化能力反映總的抗氧化活性，還原能力越大，抗氧化性越強。不同方法提取的不溶性膳食纖維的FRAP值見圖7。

圖7 不同方法提取的不溶性膳食纖維的FRAP值Fig.7 The FRAP value of IDF extracted by different methods

由圖7可知，微波輔助法提取的IDF的FRAP值（59.3 μg VC當量/mL）最高，顯著高于其它4種方法提取的IDF。酸堿法、超聲輔助堿法、雙酶法和超聲輔助酶法提取的IDF的FRAP值之間并無顯著性差異。

3 結論

本研究利用酸堿法、超聲輔助堿法、微波輔助法、雙酶法和超聲輔助酶法5種方法提取青錢柳葉片殘渣中不溶性膳食纖維，并比較其IDF之間的理化性質和抗氧化活性差異。紅外光譜顯示，5種方法提取的IDF均具有纖維素類多糖的特征吸收峰，且峰形相似，表明其結構和化學鍵類型基本相同。酸堿法和超聲輔助堿法提取的IDF具有較高的膨脹率；超聲輔助堿法提取的IDF具有良好的持水力和持油力，顯著高于其它4種方法提取的IDF。不同方法提取的IDF抗氧化活性之間存在差異。微波輔助法、雙酶法和超聲輔助酶法提取的IDF具有較高的DPPH自由基和羥基自由基清除率；微波輔助法提取的IDF鐵離子還原/抗氧化能力顯著高于其它4種方法提取的IDF。綜合各因素考慮，微波輔助法提取的IDF具有較高的抗氧化活性，并且相比于其它方法，在提取時間、成本、能耗等方面具有明顯優勢，在下一步擬重點研究優化微波輔助法的提取工藝，為利用青錢柳葉片殘渣開發膳食纖維功能性產品提供依據。