超高效液相色譜-串聯質譜法檢測咖啡中黃曲霉毒素和雜色曲霉素

李碩，李莉

（1.中國計量科學研究院，北京 100029；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

黃曲霉毒素（aflatoxin，AFTs）是黃曲霉、寄生曲霉等真菌產生的一類結構相似的次生代謝產物[1]。目前已有報道的黃曲霉毒素有20余種，其中研究最多的主要有黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1），黃曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2），黃曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）和黃曲霉毒素 G2（aflatoxin G2，AFG2）[2-3]。雜色曲霉素（sterigmatocystin，STG）是 AFB1、AFG1等的合成前體物質[4]，結構與黃曲霉毒素極為相似，都含有雙呋喃環結構。毒理學試驗表明[5-6]：黃曲霉毒素和雜色曲霉素都具有肝毒性和免疫抑制效應，可誘發肝癌等癌癥疾病。國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）將黃曲霉毒素B1列為1級致癌物，雜色曲霉毒素列為2B級致癌物[7]。咖啡是世界三大飲料之一，在我國飲料消費市場中所占份額逐年提升。真菌毒素污染作為影響咖啡質量安全的關鍵風險因素之一，越來越受到人們的關注。目前，在咖啡產品中，赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是唯一受到法規監管的真菌毒素，我國食品安全國家標準GB 2761規定了研磨咖啡（烘焙咖啡）和速溶咖啡中赭曲霉毒素A的最高限量要求[8]。其它對人體具有潛在致癌性卻尚未被納入監管視線中的真菌毒素則很容易被忽視。根據國外研究報道[9-10]，咖啡生豆和烘焙咖啡豆中也可能受到黃曲霉毒素、雜色曲霉素和展青霉素的污染。目前國內有關咖啡類產品中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的研究和報道均較少，開展咖啡中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的檢測方法的研究，有利于對咖啡中真菌毒素污染水平進行監測，為咖啡中真菌毒素限量標準的制定提供技術和數據支持。

液相色譜質譜聯用技術以其卓越的靈敏度、準確性和選擇性，現已廣泛用于不同食品基質中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的分析檢測[11-16]。QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）技術早期應用于食品中農藥殘留的測定，由于該技術快捷、簡便、高效和綠色環保，目前已迅速推廣到食品檢測的其他領域[17-23]。QuEChERS與固相萃取（solid-phase extraction，SPE）的原理相似，都是利用填料與基質中的干擾物質結合從而達到吸附除雜的效果，和SPE相比操作更加簡單快捷，適用范圍也更廣。本研究將超高效液相色譜串聯質譜技術與QuEChERS樣品前處理技術相結合，開發出咖啡中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的分析方法，實現了批量樣品的快速篩查和定量檢測，為開展咖啡中多種真菌毒素的污染水平監測提供有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AFB1、AFB2、AFG1和 AFG2混合標準溶液（各化合物質量濃度為 10 μg/mL）、STG 標準溶液（10 μg/mL）：青島普瑞邦生物工程有限公司；乙腈（色譜純）：德國Merck公司；甲酸（質譜級）：美國Fisher Scientific公司；氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純）：國藥集團化學試劑公司；SHIMADZU WondaPakQuEChERS凈化管（2 mL，25 mg PSA，25 mg C18，150 mg MgSO4）：日本島津公司；LUMTECH MPFC-QuEChERS超濾型凈化柱（適用于復雜基質）：北京綠綿科技有限公司；Waters PRiME HLB凈化柱（60 g/3 mL）：美國Waters公司；試驗用水均為超純水；咖啡豆、咖啡粉、速溶咖啡、濃縮咖啡：市售。

1.2 儀器與設備

LC20AD超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀：日本島津公司；AL 204型電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；Advance RO+Pro VF超純水純化系統：德國Sartorius公司；KQ-3200DE超聲波清洗器：江蘇昆山市超聲儀器有限公司；Vortex Genie 2型渦旋混勻器：美國Scientific Industries公司；GTR21-1B型醫用離心機：北京新時代北利醫療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

精密稱取2.5 g（精確至0.000 1 g）咖啡粉樣品（咖啡豆需事先研磨成粉）或液體咖啡樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈混合提取液（乙腈∶水∶甲酸=70∶25∶5，體積比），旋渦混勻 30 s后，在室溫（25℃）下超聲提取30 min。隨后向離心管中加入1 g氯化鈉和4 g無水硫酸鎂，劇烈振搖1 min，經8 000 r/min轉速離心5 min。移取1 mL上清液過 SHIMADZU Wonda－PakQuEChERS凈化管凈化，經0.22 μm聚四氟乙烯針頭濾器過濾，濾液待上機測定。

1.3.2 標準溶液的制備

分 別 準 確 移 取 1 mL AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和STG標準溶液置于10 mL棕色容量瓶中，用50%的乙腈水溶液稀釋，定容后搖勻，配制成各組分質量濃度為1 μg/mL的標準混合儲備溶液。移取1 mL標準混合儲備溶液置于10 mL棕色容量瓶中，用50%的乙腈水溶液稀釋并定容，配制成各組分質量濃度為100 μg/L的混合中間標準溶液，于-20℃避光保存。

1.3.3 基質標準溶液的制備

稱取不含5種真菌毒素的咖啡粉空白基質，按照試驗方法進行樣品前處理，得空白基質提取溶液，用空 白 基 質 提 取 溶 液 配 制 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和STG 質量濃度分別為 1、2、5、10、15、20 μg/L 的系列基質標準工作溶液，現用現配。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：安捷倫Infinity Poroshell 120SB-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相：A為水（含有0.1%甲酸），B為乙腈（含有 0.1%甲酸）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40℃，進樣量：5 μL。梯度洗脫程序：0～1 min，10%～20%B；1 min～9 min，20%～40%B；9 min～12 min，40%～95%B；12 min～14 min，95%B；14.1 min～16 min，10%B。

1.3.5 質譜條件

離子源：采用電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），正離子掃描；檢測模式為多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；接口溫度為300℃，接口電壓為4.0 kV；霧化為氮氣，氣流量為3 L/min，干燥氣為氮氣，流量為10 L/min，加熱氣為氮氣，流量為10 L/min。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

分別將質量濃度為 50 μg/L 的 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和STG標準溶液注入質譜儀，在正、負2種離子模式下進行一級質譜掃描。對比各化合物母離子在正、負離子模式的響應可知，5種化合物均在正離子模式下有更高的響應，因此選擇正離子掃描模式進行下一步優化。對5種化合物的[M+H]+母離子進行二級質譜掃描，并在多反應監測模式下優化電壓和碰撞能，選擇響應強度最高的2個子離子作為定性和定量離子。優化后的 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和 STG 的母離子、子離子及質譜參數見表1。

表 1 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和 STG 的質譜參數Table 1 MS parameters of AFB1，AFB2，AFG1，AFG2and STG

2.2 色譜條件的優化

試驗對比了AglientPoroshell 120SB-C18柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）、Waters BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和 Waters HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）柱對于5種化合物的分離效果，研究發現Aglient－Poroshell 120 SB-C18柱由于填料為實心核殼顆粒，相比傳統化的全多孔顆粒具有更窄的粒徑分布，能夠提高柱效和分離度并降低柱壓，對于AFB2、AFG1的分離效果要明顯好于另外兩款色譜柱。因此選用Aglient－Poroshell 120 SB-C18柱作為分析柱，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和STG的質譜總離子流圖（total ion chromatography，TIC）如圖 1 所示。

圖1 黃曲霉毒素和雜色曲霉素TIC圖Fig.1 Total ion chromatography of aflatoxins and sterigmatocystin

2.3 樣品前處理條件的優化

2.3.1 提取溶劑優化

乙腈和甲醇是食品中真菌毒素最常用的提取溶劑。乙腈具有沉淀蛋白的作用，對于咖啡這類油脂和蛋白質較豐富的樣品具有更好的選擇性，因此本試驗采用乙腈作為提取溶劑。對于咖啡粉樣品，提取溶液中有水存在時，有利于乙腈向基質內部的滲透，從而提高提取效率。此外，提取體系中加入無機鹽可以促進乙腈與油相和水相分層，降低雜質在乙腈中的溶解度，起到初步凈化的效果。本試驗以不含5種真菌毒素的咖啡粉為空白基質，通過加標試驗并計算加標回收率的方式，考察了5種提取溶劑（1：乙腈和水體積比為70∶30；2：乙腈和水體積比為 80∶20；3：乙腈和水體積比為 90∶10；4：乙腈、水、甲酸體積比為 70∶25∶5；5：乙腈、水、甲酸體積比為70∶20∶10）對目標化合物回收率的影響，試驗結果見圖2。

圖2結果表明，用乙腈和水作為提取溶劑時AFG1、AFG2回收率較低，但當提取溶劑中加入5%的甲酸后，AFG1、AFG2的回收率有了明顯的提高，加入少量的甲酸可以提高AFG1、AFG2的提取效率，但是酸度過高，5種目標化合物的回收率都明顯降低。綜合考慮5種化合物的回收率結果，最終選擇乙腈-水-甲酸溶液（體積比為 70∶25∶5）作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑對提取率的影響Fig.2 The effect of extracting solvents on recoveries of aflatoxins and sterigmatocystin

2.3.2 凈化方式優化

試驗考察了3種含不同填料的QuEChERS樣品凈化方式（A：SHIMADZU WondaPak QuEChERS凈化管；B：LUMTECH MPFC-QuEChERS 超濾型凈化柱；C：Waters PRiME HLB凈化柱）對5種真菌毒素提取回收率的影響，結果見圖3。

圖3 凈化方式對提取率的影響Fig.3 The effect of clean-up methods on recoveriesof aflatoxins and sterigmatocystin

圖3試驗結果表明，采用SHIMADZU WondaPak QuEChERS凈化管凈化的回收率要高于其他兩種凈化方式，5種化合物的回收率為69.5%～110.6%，滿足食品理化檢測的試驗要求。

2.4 線性關系考察

基質效應是影響質譜檢測結果準確性的重要因素之一，目前常用的補償基質效應影響的方法有同位素內標法和基質匹配校正曲線法[24-25]。同位素內標價格昂貴，不易獲得，因此本試驗采取基質校正曲線法進行定量測定。分別將1.3.3中的系列基質標準工作溶液注入質譜儀進行測定，以目標物質的色譜峰面積為縱坐標，相應的質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，并計算回歸方程和相關系數。以加標基質樣品中各化合物色譜峰響應的3倍信噪比計算檢出限（limit of detection，LOD）、10 倍信噪比計算定量限（limit of quantity，LOQ）。咖啡中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的相關技術指標見表2。

表2 咖啡樣品中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的線性范圍、相關系數、檢出限及定量限Table 2 Linear ranges，correlation coefficients，LODs and LOQs of aflatoxins and sterigmatocystinin coffee samples

表2結果顯示，5種真菌毒素含量在1 μg/L～20 μg/L范圍內線性關系良好，各真菌毒素的相關系數均大于0.99。

2.5 加標回收率

分別向不含5種真菌毒素的咖啡粉空白基質中添加 3 個濃度水平（2、10、20 μg/kg）的 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和STG混合標準溶液進行加標回收率測定，每個添加水平制備6個平行樣品上機檢測。計算5種真菌毒素的平均回收率及相對標準偏差（relative standard deviations，RSD），結果見表 3。

表3 咖啡樣品中黃曲霉毒素和雜色曲霉素回收率（n=6）Table 3 Recoveries of aflatoxins and sterigmatocystin in coffee samples（n=6）

由表3可知，咖啡中5種真菌毒素的平均回收率為88.2%～119.0%，RSD為1.9%～13.2%，說明該方法準確性和重現性良好，可以滿足日常檢測的要求。對于添加質量濃度水平2 μg/kg的回收率來說，5種真菌毒素的加標回收率RSD均高于添加質量濃度水平10 μg/kg和20 μg/kg的回收率RSD，原因可能是咖啡樣品基質復雜，在待測化合物含量處于較低水平時，樣品基質效應相對被放大，其產生的背景噪音對樣品中待測物質的質譜響應干擾較為顯著；當待測溶液中待測化合物含量處于較高水平時，樣品基質效應產生的背景噪音相對于待測物質的質譜響應影響減弱。

2.6 實際樣品測定

為了監測市售咖啡中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的污染水平，本試驗從咖啡店、超市及網絡購物平臺等渠道購買了50批咖啡，涵蓋了烘焙咖啡豆、研磨咖啡粉、掛耳咖啡粉、膠囊咖啡粉、速溶咖啡粉和濃縮咖啡糖漿等主要樣品形態，包括了市場上主流品牌在內的20多個咖啡品牌。應用本試驗建立的方法對市售的50批咖啡樣品進行了檢測，50批咖啡樣品中均未檢出 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和 STG，表明我國市售咖啡中黃曲霉毒素和雜色曲霉素污染水平較低。

3 結論

本研究采用QuEChERS技術進行樣品的前處理，并結合UPLC-MS/MS檢測技術，建立了咖啡中4種黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1和 AFG2）和雜色曲霉素的快速篩查方法，該方法操作簡便，具有良好的選擇性和靈敏度，適用于咖啡中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的定性確證與定量檢測。