基于RAPD技術對窖泥梭菌近似菌株的分類研究

林世剛，田雨思，毛輝，鄒偉，2，葉光斌，2*

（1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 自貢 644000；2.四川輕化工大學 釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 643000）

濃香型白酒位列中國白酒四大基礎香型之首，其獨特風味得益于微生物菌群的生長和代謝以及復雜的協同作用[1]。在窖泥環境中，梭菌屬被認為是豐富度較高的物種。其能夠利用淀粉等有機質產生多種物質包括己酸、丁酸、乙酸等，以及產生多種醇、醛、酮等化合物，對酒體風味物質貢獻較大，典型的有庫氏梭菌（Clostridium kluyveri）、酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）和丁酸梭菌（Clostridium butyricum）等[2]。胡曉龍等[3]對庫氏梭菌 N6（Clostridium kluyveri N6）進行了研究，并發現其代謝產物較為豐富，包括一些酯類和醇類等。也有研究表明丁酸梭菌（Clostridium butyricum）在發酵過程中會產生一些抗菌肽物質丁酸梭菌素抑制雜菌的生長[4]。梭菌不僅具有產生酒體風味物質的能力，其一些自身代謝產物也參與窖泥中其他菌體的代謝和生長，進而使酒體風味更加豐富。對窖泥中的梭菌進行研究，有助于分析和利用窖泥微生物資源，為調控濃香型白酒品質和產量的研究提供理論支持。窖泥中微生物種類繁多，功能各不相同，明確其分類地位及與表型特征之間的關系是研究利用窖泥微生物種群資源的重要一環。

傳統方法中，通常會綜合表型性質，如菌落及顯微形態、產酶特性、發酵產物等對細菌進行初步的鑒定；該方法在判斷具有相似表型性狀但在遺傳學上沒有實質關聯的菌株時不夠準確[5]。基于16S rDNA序列的系統發育樹分析是現有微生物分類方法中最為快速和常規的方法。但是對于16S rDNA序列相似度高的近似種或亞種，它們難以通過傳統方法和現在16S rDNA序列鑒定區分開來[6]。因此有必要通過其他方法將它們做進一步的區分。學者們提出了很多以DNA為目標物的近似菌株的分型方法，主要有限制性片段長度多態性分析技術（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、擴增片段長度多態性分子分型（amplified restriction fragment polymorphism，AFLP）、脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）、多位點序列分型（multi locus sequence typing，MLST）、變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、隨機擴增多態性DNA標記等[7-16]。最新應用在細菌分型上的技術還包括紅外光譜分析和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜等[17-18]。

RAPD技術是一種基于基因組聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的多態性分析的分子分型技術，最早由Williams等[19]在1990年提出，其原理：以長度為10 bp的隨機核苷酸作為引物，對研究菌種的DNA進行PCR擴增，將擴增產物經過瓊脂糖凝膠電泳分離，最終顯示為不同的擴增圖譜，再對其進行聚類分析。RAPD的研究和應用較為廣泛，對新種的確定和相似菌株的分類有很強的參考意義。近年來，RAPD分型在醫學上使用較多，Azimirad等[20]采用RAPD分型技術成功對腹瀉患者艱難梭菌進行了分型。Shoaei等[21]則使用RAPD分型研究了對伊朗糖尿病患者耐藥艱難梭菌的基因多態性，并比較了不同RAPD簇之間菌株基因的相似性。但目前在窖泥近似菌株的分型中未見報道。

本研究通過篩選的4種多態性良好的隨機引物對窖泥中19株近似梭菌進行RAPD分型，旨在分析濃香型白酒窖泥中16S rDNA序列相似度大于97%的近似菌種的物種多樣性，能夠為后續該類菌株分類及開發研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試菌株和隨機引物

從四川某酒廠窖泥和窖泥富集液中共分離獲得22株梭菌，其中有19株難以鑒定到種，菌種O1-5Da、Tz-1、5-20由于菌種遺失導致關于這3株菌株的試驗無法重復，故不參與此次試驗后續的RADP分型分析。供試菌株基本信息見表1。本試驗所用隨機引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，編號及隨機引物的序列信息見表2。

表1 供試菌株基本信息（基于16S rDNA序列的分類依據）Table 1 The basic information of tested strains（identification information were based on 16S rDNA sequences）

表2 隨機引物序列Table 2 Random primer sequences information

1.1.2 儀器與試劑

AW200SG厭氧工作站：金壇市科技分析儀器有限公司；HW326恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；ZHWY-103D恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；BF-2000M氮吹儀：北京八方世紀科技有限公司；S1000 PCR儀：百樂科技有限公司；JY-600C電泳儀：北京君意東方電泳設備公司；SC805凝膠成像儀：上海山富科技儀器有限公司；SpectraMax Drop核酸蛋白質超微定量系統：美谷分子儀器（上海）有限公司；Allegra 64R高速冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司；DM3000M顯微鏡：德國徠卡公司。

細菌DNA快速提取試劑盒：北京艾德萊生物科技有限公司；PCR擴增試劑：5×Buffer（含Mg2+）、擴增引物、5 U/μL DNA聚合酶：上海擎科生物公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 近似菌株的16S rDNA序列的系統發育樹分析

將田雨思等[22]保藏菌株的16S rDNA序列與LPSN（List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature）網站標準梭菌屬菌株序列合并在一起進行系統發育樹分析，使用鄰接法（neighbor-joining method，NJ法）在MEGA 6.0軟件中構建系統發育樹。

1.2.2 隨機引物的篩選方法

從19株供試菌株中選擇4株代表菌種3-3、B2-1、G3-3、G3-5進行10種不同隨機引物的RAPD反應，菌株5-20由于菌株遺失，不參與分析。根據產物電泳后條帶的數目、亮度、特異性等篩選出適用于分型的隨機引物。

1.2.3 RAPD擴增條件

RAPD反應體系：總體積為50 μL，包括5×Buffer（含 Mg2+）10 μL，1 mmol/L dNTPs 1 μL，引物濃度10 nmol/L 5 μL，Taq DNA 聚合酶 1 μL，模板 DNA 1 μL，加無菌水補足至50 μL。PCR擴增條件：94℃預變性2 min，94℃變性 1 min，40.2℃退火 1 min，72℃延伸1 min，45個循環后，72℃延伸10 min。使用3%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳條件：110 V，30 min。電泳完成后取出進行紫外凝膠成像。

1.2.4 聚類分析方法

根據電泳圖譜比較不同菌株的擴增產物，以100bp DNA Ladder Plus標準條帶為參照，對RAPD成像圖上同一水平的條帶有無進行統計，有擴增條帶（不論強弱）計為“1”，無條帶計為“0”，建立 0/1矩陣。根據以上所得0/1矩陣，采用NTsys2.10軟件選擇UPGMA算法進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 近似梭菌菌株與標準菌株間的16S rDNA序列系統發育樹分析

供試梭菌在整個梭菌類群中的系統發育樹見圖1。

圖1 供試梭菌在整個梭菌類群中的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of tested Clostridium species in the taxonomy system of whole Clostridium group

從整個梭菌系統發育樹中分析，JL3-1、G3-1、G3-3、G3-5、C2-2、4-30、2-1、2-11、2-24、3-4、3-8 共11株與拜氏梭菌類聚為一類。拜氏梭菌類除了拜氏梭菌外，還包括 C.saccharobutylicum、C.chromiireducens、C.puniceum、C.saccharoperbutylacetonicum，它們間的16S rDNA序列相似度均超過97%以上，因此通過16S rDNA系統發育樹分析很難將與拜氏梭菌等近似的11株菌株鑒定到具體的種級水平；菌株B2-1、F1-1與廣西梭菌（C.guangxiense）近似，廣西梭菌與其近似菌種（C.neuense）在系統發育樹上被歸為一簇，這2個標準菌株間的16S rDNA序列相似度高達98.2%；丁酸梭菌（C.butyricum）在系統發育樹中被單獨歸為一簇，目前還沒有報道序列相似度超過97%的近似菌株，本試驗菌種中的 JL3-4、JL3-5、SZ-1、SZ-2、SZ-8、3-3 被鑒定為丁酸梭菌，但是否存在潛在新種有待進一步的驗證。

2.2 最佳擴增引物的篩選結果

隨機引物篩選的RAPD電泳圖譜見圖2。

圖2 隨機引物篩選的RAPD電泳圖Fig.2 RAPD electrophoresis of random primer screening

根據已經測序的19株梭菌分類信息，選取5株菌（菌株編號 3-3、5-20、B2-1、G3-3、G3-5） 的基因組DNA作為模板，對上述10個隨機引物進行PCR擴增。由圖2可知，引物U10、T05在本次RAPD反應中幾乎沒有雜條帶，且條帶清晰、亮度適合、擴增特異性較強。引物C06、W14也有多條比較清晰明亮的條帶。因此，根據電泳結果選擇隨機引物C06、U10、T05和W14進行后續RAPD分型分析。

2.3 RAPD擴增結果及聚類分析

19株供試菌株RAPD擴增試驗的結果見圖3。基于RAPD 0/1矩陣構建的19株近似梭菌聚類分析圖見圖4。選擇遺傳距離為0.82進行聚類，可將上述的19株菌株分為10類，結果見表3。

表3 供試梭菌的聚類分析Table 3 Cluster analysis of Clostridium tested

圖3 供試梭菌的RAPD電泳圖譜Fig.3 RAPD electrophoresis of tested Clostridium strains

圖4 基于RAPD 0/1矩陣構建的19株近似梭菌聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis of 19 Clostridium similar strains based on RAPD 0/1 matrix

從圖3可看出4個隨機引物其PCR擴增的條帶數目在1條～12條之間。其中引物C06和U10擴增出的條帶較多，多態性較好，而引物T05和W14擴增出的條帶較亮且較為清晰。同一近似種近似菌株間的RAPD擴增存在條帶差異。例如近似于拜氏梭菌的4-30、C2-2 在隨機引物 C06、T05、U10 的擴增中均與其他拜氏梭菌近似菌株有不同的條帶數目；近似于廣西梭菌的菌株F1-1和B2-1則在4種引物的擴增中均存在明顯的差別。后續根據條帶有無構建的0/1矩陣，運用NTSYS2.10軟件進行聚類分析，可將上述19株菌株分型為10類。

其中與拜氏梭菌菌群近似的11株菌株可分為6個小類，包括 2-1 類（2-1、2-11、2-24）、4-30 類、C2-2類、G3-1類（G3-1、G3-3）、G3-5類、JL3-1類。與丁酸梭菌菌群近似的6株菌可分為2類，包括3-3類（3-3、SZ-1）、JL3-4 類（JL3-4、JL3-5、SZ-2、SZ-8）。將廣西梭菌近似的2株菌為2類，包括B2-1類、F1-1類。整合16S rDNA序列分析、RAPD分型的分析結果，可以確定3種菌群中存在新種或亞種的可能性較大。

3 結論與展望

通過16S rDNA序列分析、RAPD分型，可將實驗室保藏的窖泥來源的19株近似梭菌分為10個小類。其中與拜氏梭菌近似的11株菌可細分為6類，它們與標準菌株 C.beijerinckii strain ATCC 25752、C.saccharobutylicum strain DSM 13864、C.chromiireducens strain DSM 23318、C.puniceum strain DSM 2619、C.saccharoperbutylacetonicum strain DSM 14923間的遺傳關系較為接近，但具體遺傳地位較為模糊；與廣西梭菌近似的2株梭菌也要開展它們與C.guangxiense strain BCRC 80950、C.neuense strain BCRC 80949 模式菌株的遺傳關系的研究；上述菌種是否存在潛在新種有待進一步的研究。由于丁酸梭菌未報到近似新種，本次研究的丁酸梭菌菌株存在2個小類，說明窖泥來源的丁酸梭菌內存在潛在新種，后續需要開展它們與C.butyricum strain ATCC 19398模式菌株的遺傳關系及新種研究。從上述結果可以看出在白酒窖池內可能存在較多未被報道的新種資源，有待更進一步的研究。

厭氧梭菌作為近年來窖泥研究熱點，學者們只能對其中小部分菌株進行分離培養，對不可培養的菌株的研究一般采用生物技術提取窖泥總DNA進行宏基因組擴增子測序，對窖泥群落結構進行研究。然而現有的宏基因組擴增子測序研究中基于16S rDNA序列相似度大于等于97%的都歸為同一可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）的判定可能會低估窖泥微生物種群的多樣性。同樣，對于已經鑒定的菌種，如果不對其全基因組進行分析，而光依靠16S rDNA相似度作為鑒定依據很有可能忽略潛在的新種或者亞種，RAPD技術也是判定此類問題的有效方法之一。