益黃散治療小兒慢性腹瀉的網絡藥理學研究

劉思佳，謝靜

益黃散治療小兒慢性腹瀉的網絡藥理學研究

劉思佳，謝靜*

湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208

采用網絡藥理學探討益黃散治療小兒慢性腹瀉的分子作用機制，為臨床用藥提供依據。通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）挖掘益黃散藥物有效成分，導入PubChem、SwissTargetPrediction數據庫預測有效成分潛在靶點；在GeneCards數據庫中檢索小兒慢性腹瀉靶點，將有效成分靶點與疾病靶點取交集，并繪制中藥-有效成分-疾病網絡。通過STRING 11.0數據庫構建蛋白相互作用網絡，運用Cytoscape3.8.1軟件Network analyzer功能整合并構建藥物成分-靶點-疾病的多層次網絡關系。通過DAVID數據庫對交集靶點進行GO功能富集及KEGG通路富集分析。收集并篩選益黃散有效成分19個、藥物靶點541個，小兒慢性腹瀉疾病靶點2574個，二者交集靶點134個，其中PIK3CA、STAT3、VEGFR、AKT1、EGFR等基因靶點相互作用明顯。GO功能富集得到生物過程條目358個，細胞成分條目4個，分子功能條目42個；KEGG通路富集共計82條信號通路，主要調控癌癥途徑、癌癥中蛋白聚糖、Ras信號通路、PI3K-Akt信號通路、局灶性粘連、MAPK信號通路等。本研究揭示了益黃散在小兒慢性腹瀉治療中多途徑、多靶點、多成分的作用特點，可為后續研究提供理論基礎。

益黃散；腹瀉；小兒慢性腹瀉；網絡藥理學；信號通路；靶點

小兒慢性腹瀉（infantile chronic diarrhea）是嬰幼兒常見病、多發病，病程＞2個月者為慢性腹瀉，若病情遷延不愈可影響小兒生長發育，是造成兒童生長發育障礙的主要原因。目前臨床治療小兒慢性腹瀉多用腸道黏膜保護劑或腸道微生態制劑改善腸道微生態環境，從而實現止瀉[1]。

益黃散出自宋代錢乙《小兒藥證直訣?卷上?脈診治法》，又名補脾散，方中青皮、陳皮、丁香理氣祛濕，訶子收斂固澀，甘草調中補益，全方行氣祛濕，則脾氣自運[2]。益黃散現代常用于治療嬰幼兒腹瀉、小兒消化不良，改善機體免疫力等[3]。明代萬全評價益黃散“治脾胃寒濕太甚，神品之藥也。以補脾胃之虛誤矣”。萬全在錢乙對小兒體質辨為“易虛易實，易寒易熱”的基礎上提出“脾常不足”，指出“脾胃虛弱，萬病峰起”，脾胃功能直接關系小兒機體健康及生長發育[4]。本研究通過網絡藥理學研究益黃散中各藥物成分，探討益黃散治療小兒腹瀉的作用機制。

1 材料與方法

1.1 益黃散有效成分及靶點篩選

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[5]收集益黃散中陳皮、丁香、訶子、青皮4味藥的有效成分，因甘草為常用佐使藥，本文不予討論。根據人體藥物的吸收、分布、代謝、排泄、毒性參數，以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為條件進行主要有效成分篩選[6]。

1.2 中藥有效成分靶點預測與疾病靶點預測

通過PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/）[7]獲取中藥有效成分結構，并保存為SDF格式，將其導入SwissTargetPrediction數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）[8]中進行靶點預測，剔除無法預測的有效成分。

通過GeneCards數據庫[9]（https://www. genecards.org/），以“infantile chronic diarrhea”為檢索詞進行檢索，獲取疾病靶點。

1.3 藥物-疾病共同靶點獲取

在生物信息學在線網站（http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/Venn/）導入中藥有效成分預測靶點與疾病靶點的相關基因數據，繪制韋恩圖，交集靶點為藥物成分-疾病共同靶點。

1.4 蛋白相互作用網絡構建

將共同靶點導入STRING 11.0數據庫（http://www.string-db.org）[10]，選用Multiple proteins工具，物種組織設定為“homo sapiens”，設置默認參數值，篩選出網絡關鍵靶點，獲得交集靶點的蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，得到PPI網絡圖。將PPI網絡CSV格式文件導入Cytoscape3.8.1軟件[11]，繪制中藥-有效成分-疾病網絡。對網絡拓撲結構信息進行計算，在工具Analyze Network中調整degree值，以節點degree值反映靶點作用大小，根據degree值對靶點進行篩選分析。利用BisoGenet插件3.3.0對藥物-疾病-靶點進行PPI構圖分析。

1.5 生物通路分析

將篩選后得到的共同靶點通過WebGesstalt數據庫（https://www.webgestalt.org/#）[12]進行基因本體論（GO）分析，限定物種為“homo sapiens”進行ORA（over-representation analysis）分析，設定顯著性水平＜0.05，獲得藥物靶點的生物過程，分別導出細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）條目進行分析，進行加權集合覆蓋分析后繪制火山圖。

利用DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）[13]進行京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，收集＜0.01、最小計數為3、富集因子＞1.5的條目，對排名前20位的通路與靶點整合構建通路圖。

2 結果

2.1 益黃散有效成分及對應靶點

通過TCMSP共檢索出益黃散有效成分314個，其中陳皮63個、青皮18個、丁香117個、訶子116個，剔除無化學結構及靶點的有效成分，經篩選后得到符合標準的有效成分19個，其中包括陳皮5個（MOL000359、MOL004328、MOL005100、MOL005815、MOL005828），丁香4個（MOL000358、MOL000422、MOL000449、MOL000098），青皮4個（MOL001803、MOL004328、MOL005100、MOL005828），訶子6個（MOL009135、MOL001002、MOL009149、MOL009137、MOL006826、MOL009136）。通過PubChem數據庫獲取益黃散有效成分對應靶點541個。

2.2 疾病靶點及交集靶點

通過GeneCards數據庫篩選獲得小兒慢性腹瀉靶點2574個，設置Relevance score＞4.902935028（兩倍中位數），經篩選后得到645個靶點，取中藥有效成分靶點與疾病靶點交集，得到交集靶點71個（見圖1）。

圖1 益黃散-小兒慢性腹瀉基因靶點韋恩圖

2.3 蛋白相互作用網絡

將交集靶點導入STRING 11.0數據庫，設置minimum required interaction score為最高置信度0.9，隱去游離節點后，得到71個節點、155條連線關系，構建PPI網絡圖（見圖2）。71個節點的平均degree值為4.37，節點越大，degree值越高，連線越多，表示蛋白之間的關系越緊密[14]。PPI網絡顯示，共有靶蛋白的節點58個，表示相互作用的線155條，其中血管內皮生長因子（VEGFA）與轉錄激活因子3（STAT3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、編碼p53蛋白（TP53）等相互作用。

2.4 GO功能富集分析結果

BP富集結果共計358個，主要富集于跨膜轉運的正調控、對藥物的反應、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、蛋白質自磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化、凋亡過程的負調控、積極調控細胞增殖、凋亡過程的負調控、細胞運動的正調控，氧代謝過程、神經遞質的調節、類固醇代謝過程、DNA轉錄因子的調控、從RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、從RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的負調控、蛋白質磷酸化、積極調節GTPase活性、信號轉導。見圖3。

圖2 益黃散治療小兒慢性腹瀉靶點PPI核心網絡

圖3 益黃散治療小兒慢性腹瀉GO功能富集生物過程分析

CC富集結果共4個，主要富集于內體、復合物的組成部分，見圖4。

圖4 益黃散治療小兒慢性腹瀉GO功能富集細胞組分分析

MF富集結果共42個，富集于蛋白質結合、ATP結合、磷脂酰肌醇-4,5-雙磷酸3-激酶活性、相同的蛋白質結合、鋅離子結合、蛋白質均二聚活性、絲氨酸型內肽酶活性、激酶活性，見圖5。

圖5 益黃散治療小兒慢性腹瀉GO功能富集分子功能分析

2.5 KEGG通路富集分析結果

KEGG通路富集共計82條信號通路，主要富集于癌癥途徑、癌癥中蛋白聚糖、腎素-血管緊張素（Ras）信號通路、PI3K-Akt信號通路、局灶性粘連、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、人皰疹病毒（EB）感染、缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路、甲型流感等。根據“Term”選取log10值排名前20位的結果將其進行可視化。見圖6。

圖6 益黃散治療小兒慢性腹瀉KEGG富集分析

3 討論

3.1 益黃散治療小兒慢性腹瀉的應用

小兒慢性腹瀉發病機制復雜，目前認為其病因分為感染性因素和非感染性因素，感染性因素包括病毒、細菌、真菌等病原菌感染，非感染性因素則包括氣候因素或長期飲食喂養不當及免疫功能低下等。由于小兒胃腸功能尚未發育完全，小腸黏膜被病毒或其他病原微生物直接侵襲，導致腸道微生態平衡及腸黏膜完整性被破壞，引起腸道內電解質和水運轉出現失調，導致腹瀉[15]。據相關文獻報道，益黃散具有促進免疫蛋白IgA、IgG表達，提高炎癥控制效果，改善機體免疫功能的功效[16]。

腹瀉屬于中醫學“泄瀉”范疇，中醫認為腹瀉的發生與脾虛密切相關，脾氣健運則外邪不侵。錢乙注重脾胃氣機升降，善用甘溫運化之藥。益黃散方中陳皮、青皮專理肝脾宿痰、燥濕理氣，丁香溫中止嘔，訶子澀腸止瀉，甘草補脾和胃。小兒脾常不足，脾胃未臻完善，飲食不知節制，乳食積滯于內，選用益黃散取其運脾為貴之意。江育仁教授提出“故欲健脾者旨在運脾，欲使脾健，則不在補而貴在運也”的學術思想[17]。現代小兒脾胃病中虛弱不足者明顯減少，但飲食不節導致脾胃功能失健者大增，運脾法受到各醫家重視與運用。

3.2 關鍵靶點結果分析

對益黃散治療小兒慢性腹瀉PPI網絡拓撲分析可知，PIK3CA、表皮生長因子受體（EGFR）、VEGFA、STAT3、AKT1、TP53的degree值較大，說明益黃散的生物活性成分與這些蛋白質的結合率較高。對交集靶點進行GO功能富集分析發現，核心靶點主要富集于跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、對藥物的反應、蛋白質自磷酸化等生物過程。PIK3CA主要參與免疫相關、炎癥相關、凋亡抑制、能量代謝等信號通路。EGFR靶點表達在人腸上皮細胞的基底外側表面膜上[18]。小兒慢性腹瀉易伴隨腸道炎癥，腸道菌群失調，嚴重時可引起局部缺血，發生微循環障礙。酪氨酸激酶受體（ErbB）抑制劑可抑制腸上皮細胞EGFR信號傳導，降低腸上皮的生長和修復能力，導致腸黏膜萎縮和分泌性腹瀉。激活EGFR有助于修復腸道黏膜上皮細胞，吸收腸液，緩解腹瀉。VEGFA是一種能誘導血管內皮細胞增殖與遷移的因子，與炎性指標、疾病活動及功能指標具有正相關性，參與固有免疫調節，VEGFA能促進血管生成，改善腸道缺血缺氧環境[19]。信號傳導及STAT3與自身免疫疾病、復發性感染等疾病有關，對輔助性T細胞17的分化有重要作用。STAT3是一類位于染色體17q21區域的轉錄因子，EGFR刺激DNA結合蛋白酶的STAT3產生反應，其激活引發的炎癥反應可能導致腸上皮屏障功能失調，以及與電解質和水運輸失調相關的腸道炎癥，從而導致腹瀉[20]。研究表明，microRNA可通過靶向抑制STAT通路分子STAT3蛋白表達，進而抑制腸道病毒71的核酸和蛋白復制[21]。AKT1廣泛表達于人體各個組織，參與細胞生存及生長調控，在細胞的生長與凋亡中起到重要作用。AKT1可能是通過提高細胞因子活性、促進病變細胞凋亡以達到治療小兒慢性腹瀉的目的[22]。

3.3 通路與生物過程分析

KEGG通路富集分析結果表明，益黃散涉及的主要炎癥通路有PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路。PI3K-Akt信號通路對細胞代謝具有多樣化的下游效應，可直接調控營養轉運蛋白和代謝酶，調節關鍵的代謝過程，在腸道炎癥中發揮重要作用[23]。腹瀉的發生與炎癥反應、腸道內微環境變化密切相關[22]。PI3K信號通路一旦被激活，引起Akt磷酸化，進而通過p53非依賴方式抑制細胞凋亡。鑒于炎癥因子與凋亡存在一定相關性，推測益黃散治療小兒慢性腹瀉可能通過促進PI3K-Akt信號通路表達，抑制腸道上皮細胞凋亡，控制腸炎發生[22]。腹瀉在缺血缺氧的腸道疾病中十分常見，有研究表明，HIF-1是一種普遍存在的缺氧反應因子，是黏膜損傷期間腸道屏障保護的關鍵因素，參與多種有助于維持屏障完整性的機制，可以控制腸黏膜上皮離子和水運輸[24]。小兒慢性腹瀉可能引起機體微環境甚至腸道菌群的變化，腸道菌群與腹瀉的發生互為因果，機體局部缺血缺氧可激活HIF-1通路，增加基因表達。MAPK信號通路是引起機體胃腸動力功能紊亂及參與促炎因子應答的關鍵通路，參與炎癥調控、應激反應等過程[25]，與細胞反應的組織損傷有關。因此益黃散可能通過某些重要蛋白靶點調控PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路等，在抑制腸道炎癥反應、減輕腸道損傷、保護腸道黏膜、改善機體微環境等方面發揮重要作用。

中藥對疾病的干預作用具有“多因微效”綜合調節的特點[26]，中藥化學成分復雜且復方組合形式多樣，各中藥成分之間彼此協調作用。本文基于網絡藥理學研究，探討益黃散治療小兒慢性腹瀉機制，為中醫藥多途徑、多靶點、多成分治療疾病提供理論依據。但本文結果尚缺乏相關動物實驗及臨床驗證，有待進一步研究。

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Study onPowder for the Treatment of Infantile Chronic Diarrhea Based on Network Pharmacology

LIU Si-jia, XIE Jing*

(Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

To study the molecular mechanism ofPowder for the treatment of infantile chronic diarrhea with network pharmacology; To provide basis for clinical medication.The active components ofPowder were dug from TCMSP, and then PubChem and SwissTargetPrediction databases were imported to predict potential targets of active components; the targets of infantile chronic diarrhea were searched in GeneCards database, the intersection of active component targets and disease targets was taken, and the Chinese materia medica-active components-disease network was drawn. The protein - protein interaction network was constructed by STRING 11.0 database and Cytoscape3.8.1 Network analyzer was used to integrate and construct the multi-level network relationship of medicine composition-target-disease. GO function enrichment and KEGG pathway enrichment analysis of intersection targets were carried out through DAVID database.Totally 19 active components, 541 medicine targets ofPowder, 2 574 disease targets of infantile chronic diarrhoea, and 134 intersection targets of the two were collected and screened, among which the gene targets of the PIK3CA, STAT3, VEGFR, AKT1, and EGFR were obvious. GO function enrichment resulted in 358 biological process entries, 4 cell component entries and 42 molecular function entries;KEGG pathway was enriched with 82 signaling pathways, mainly regulating cancer pathway, proteoglycan in cancer, Ras signaling pathway, PI3K - Akt signaling pathway, focal adhesion, MAPK signaling pathway, etc.This study reveals the multi-channel, multi-target and multi-component characteristics ofPowder in the treatment of infantile chronic diarrhea, so as to provide a theoretical basis for follow-up research.

Powder;diarrhea; infantile chronic diarrhea; network pharmacology; signaling pathway; target

劉思佳,謝靜.益黃散治療小兒慢性腹瀉的網絡藥理學研究[J].中國中醫藥圖書情報雜志,2022,46(2):9-14.

R272；R285

A

2095-5707(2022)02-0009-06

10.3969/j.issn.2095-5707.2022.02.002

湖南中醫藥大學中醫學國內一流建設學科（4901-0200002002）

劉思佳，E-mail: 1250479541@qq.com

謝靜，E-mail: 982100692@qq.com

（2021-08-05）

（修回日期：2021-09-06；編輯：魏民）