七氟醚可能通過調控SIRT1-FOXO1介導的自噬對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

陳 健， 李成潔， 李 媛

(1.海南省儋州市海南西部中心醫院麻醉科， 海南 儋州 571700 2.海南醫學院第一附屬醫院麻醉科， 海南 海口 570102)

腦動脈栓塞引起的缺血性腦卒中可引起局部血供紊亂，導致高發病率和死亡率，占腦血管疾病的60%～80%。腦缺血再灌注(I/R)損傷是缺血性腦卒中的常見并發癥之一，腦I/R損傷的細胞和分子機制涉及氧化應激、自噬、凋亡、炎癥反應和壞死等多種病理過程，這些機制影響腦I/R損傷的預后[1]。因此，迫切需要一種有效的腦I/R損傷治療方法。近年來，研究人員發現自噬在腦I/R損傷的這些病理過程中發揮了關鍵作用[2]。自噬是一個高度保守的動態過程，降解長壽命或錯誤折疊的蛋白質和受損的細胞器，其功能隨著年齡的增長而下降。作為神經退行性疾病、癌癥和心血管疾病等慢性疾病的獨立危險因素，衰老是一個不可逆的生物學過程。研究表明，自噬調節衰老相關疾病，尤其是神經退行性疾病，包括阿爾茨海默病、帕金森病和缺血性卒中[3]。自噬可能因腦I/R損傷期間的缺血、缺氧和應激反應而加劇。七氟醚是一種揮發性麻醉劑，起效快，易于控制，對顱內壓和腦氧代謝率影響極小。這些因素使其成為的神經外科手術可行的麻醉劑。研究表明，七氟醚后處理可改善缺血再灌注后的神經功能，并通過抑制氧自由基的產生來保護神經元，從而防止細胞內鈣超載和興奮性氨基酸的神經毒性作用[4]。盡管有研究報道七氟醚對缺血再灌注損傷具有神經保護作用，但尚不清楚七氟醚是否通過SIRT1-FOXO1信號通路調節自噬來改善腦I/R損傷。

1 材料與方法

1.1主要試劑儀器:七氟醚(江蘇恩華藥業有限公司)；SIRT1抑制劑EX527化合物(Sigma-Aldrich公司)；TUNEL染色試劑盒(羅氏公司)；TTC染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；紫外分光光度計(NanoDrop Technologies公司)；熒光顯微鏡(尼康儀器有限公司)；石蠟切片機(Leica公司)；透射電子顯微鏡(JEOL公司)。

1.2方 法

1.2.1實驗動物及分組:60只雄性SD大鼠(240±20g)飼養溫度為22±2℃，相對濕度為55～65%，光照/黑暗周期為12h，可自由獲得食物和水的動物房中。將大鼠隨機分為5組：假手術(Sham)組、缺血再灌注損傷(I/R)組、缺血再灌注損傷組+七氟醚(I/R+Sev)組、缺血再灌注損傷組+七氟醚組+EX527(I/R+Sev+EX527)組。所有實驗動物已獲得我院倫理委員會批準。

1.2.2構建大鼠腦缺血再灌注損傷模型:使用戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，正中切口暴露右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)。將單絲尼龍縫線從右側CCA插入ICA，距Willis環約18～20mm，以阻斷右側大腦中動脈血流。MCAO誘導腦缺血90min后，緩慢拉出縫線，再灌注24h。整個手術過程中，大鼠直腸溫度保持在37℃。將大鼠置于室溫環境下，術后恢復正常飲食。Sham組僅分離動脈，但無栓動脈閉塞。I/R+Sev組大鼠再灌注后立即吸入2%七氟醚15min。I/R+Sev+EX527組大鼠在再灌注后立即吸入2%七氟醚15min和腹腔注射EX527(5mg/kg)。當大鼠吸入七氟醚時，將其放入呼吸箱內，入口孔通入含七氟醚的空氣，將麻醉氣體分析儀連接在出口孔處監測氣體濃度，使七氟醚濃度調節為2%。所有大鼠均可保持自主呼吸。

1.2.3莫里斯水迷宮試驗(Morris):Morris水迷宮由一個圓形水箱組成，水溫保持在24±2℃。將一個黑色目標平臺固定在東南象限中部水面以下2cm處，確保該平臺對大鼠不可見。將大鼠從隨機的位置放入水中自由游泳以尋找隱藏的平臺，記錄大鼠尋找平臺的時間為逃避潛伏期。如果大鼠在120s內找不到平臺，由研究將大鼠放置在平臺上30s，記錄逃逸潛伏期為120s。每只大鼠每天測試4次，每次間隔15～20min，連續5d。在第6天，撤除上述隱藏平臺，將大鼠從第一象限放入水中，觀察并記錄大鼠在90s內穿越原始平臺次數。

1.2.42,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色:將大鼠麻醉后，快速解剖取腦，然后將其放入-20℃的冰箱中20min。將每個大腦切成6個連續2mm厚度的切片，立即浸入0.2% TTC溶液中，在37℃下避光染色30min，并置于含有4%多聚甲醛的溶液中24h。正常腦組織被染成紅色，梗塞組織被染成白色。在顯微鏡下拍照，并使用Image J計算梗死面積。

1.2.5TUNEL染色:腦組織在4%甲醛溶液中室溫固定24h，隨后進行石蠟包埋，制作5μm厚度的組織切片。隨后對切片進行二甲苯脫蠟，梯度酒精水合。根據TUNEL染色試劑盒說明書進行染色，最后在光鏡下隨機選取5個視野進行觀察。正常細胞核呈藍色，凋亡陽性細胞核呈棕黃色。

1.2.6電鏡觀察自噬體空泡形成:將固定在2.5%戊二醛溶液中的大腦皮質組織在PBS中漂洗，并在室溫下用1%檸檬酸固定1h。用分級丙酮系列脫水后，在室溫下用Pon812環氧樹脂包埋12h，將大腦皮質組織切成1μm的切片。切片在室溫下用乙酸鈾酰染色30min，用雙蒸水沖洗。然后，切片在室溫下用檸檬酸鉛染色10min，用雙蒸水沖洗。通過電子顯微鏡觀察自噬體中液泡的形成。室溫下采用盲法統計自噬體數量，每個樣本選取5個區域進行統計分析。

1.2.7Western blotting檢測自噬和凋亡相關蛋白:使用RIPA裂解緩沖液從周圍皮質組織中提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度。蛋白質印跡分析通過10～12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離。從每個樣品中取等量的總蛋白30g加入到凝膠中進行電泳。隨后，將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上1.5h。接著在室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1h，然后與一抗4℃過夜孵育。PVDF膜在TBST中洗滌3次，每次10min，然后與辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔二抗(1∶3000)在室溫下孵育1h，TBST洗滌3次。根據制造商的說明，使用增強化學發光試劑顯示蛋白質條帶，以β-actin作為內部對照，采用Image J軟件對蛋白條帶進行分析。

1.2.8統計學分析:采用SPSS21.0統計學軟件對數據進行分析。所有數據均以平均數±標準差表示。多組之間比較分析采用單因素方差分析和LSD檢驗。P<0.05被認為具有顯著性差異。

2 結 果

2.1七氟醚對腦缺血再灌注損傷小鼠神經功能的影響:Morris水迷宮實驗結果顯示，與Sham組比較，I/R組大鼠逃避潛伏期延長，穿越平臺次數減少；與I/R組比較，I/R+Sev組大鼠逃避潛伏期減少，穿越平臺次數增多；與I/R+Sev組比較，I/R+Sev+EX527組大鼠逃避潛伏期延長，穿越平臺次數減少，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 七氟醚對腦缺血再灌注損傷小鼠神經功能的影響

2.2七氟醚處理后對腦梗死體積的影響:TTC染色結果顯示，Sham組大鼠腦組織沒有白色梗死灶，與Sham組比較，I/R組大鼠腦梗死體積顯著增加；與I/R組比較，I/R+Sev組大鼠腦梗死體積減少；與I/R+Sev組比較，I/R+Sev+EX527組大鼠腦梗死體積增加，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 七氟醚處理后對腦梗死面積的影響

2.3七氟醚處理后對神經細胞凋亡的影響:TUNEL染色結果顯示，與Sham組比較，I/R組神經細胞凋亡率顯著升高；與I/R組比較，I/R+Sev組神經細胞凋亡率降低；與I/R+Sev組比較，I/R+Sev+EX527組神經細胞凋亡率升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖3-1、圖3-2。

圖3-1 七氟醚處理后對神經細胞凋亡的影響

圖3-2 七氟醚處理后對神經細胞凋亡的影響

2.4七氟醚處理后對自噬的影響:透射電鏡結果顯示，與Sham組比較，I/R組自噬空泡數量明顯增加；與I/R組比較，I/R+Sev組自噬空泡數量顯著減少；與I/R+Sev組比較，I/R+Sev+EX527組自噬空泡數量增多，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 七氟醚處理后對自噬的影響

2.5七氟醚處理后對自噬和凋亡相關蛋白表達的影響:Western blotting結果顯示，與Sham組比較，I/R組的Bad，cleaved caspase-3，Beclin-1,LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低；與I/R組比較，I/R+Sev組的Bad，cleaved caspase-3，LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達顯著降低，Bcl-2、p62蛋白表達顯著升高；與I/R+Sev組比較，I/R+Sev+EX527組的Bad，cleaved-caspase-3，LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達顯著升高，p62、Bcl-2蛋白表達顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 七氟醚處理后對自噬和凋亡相關蛋白表達的影響

2.6七氟醚處理后對SIRT1-FOXO1信號通路相關蛋白表達的影響:Western blotting結果顯示，與Sham組比較，I/R組的SIRT1、FOXO1蛋白表達顯著降低；與I/R組比較，I/R+Sev組的SIRT1、FOXO1蛋白表達顯著升高；與I/R+Sev組比較，I/R+Sev+EX527組的SIRT1、FOXO1蛋白表達顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 七氟醚處理后對SIRT1-FOXO1信號通路相關蛋白表達的影響

3 討 論

七氟醚是一種理想的神經外科麻醉藥，具有血氣分布系數低、蘇醒誘導快、腦氧代謝率降低的特點。七氟醚后處理可抑制腦組織的過度氧化應激和炎癥反應，減輕腦I/R損傷的嚴重程度。此外，七氟醚通過調控PI3K-AKT-mTOR信號通路，可降低神經元凋亡，抑制自噬，減輕腦I/R損傷。在本研究中，Morris水迷宮實驗和TCC染色證實了七氟醚減輕神經功能缺損，并顯著減少腦梗死體積，提示七氟醚在大鼠MCAO后再灌注期發揮神經保護作用。

腦I/R損傷是缺血性腦血管病溶栓治療過程中加重的繼發性損傷，主要涉及能量代謝紊亂、炎癥介質釋放、自由基損傷、興奮性氨基酸釋放、誘導凋亡。細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種形式，是由基因調控的一種活躍的細胞死亡過程。在腦I/R損傷中，大量腦組織凋亡直接導致神經功能損害。抑制腦I/R損傷后caspase依賴的細胞凋亡可減少皮質組織損傷，促進神經修復，從而改善患者預后。在本研究中，TUNEL實驗結果表明，七氟醚可通過抑制腦I/R損傷誘導的神經元凋亡來保護神經元，且七氟醚降低了促凋亡因子caspase-3和Bax的表達，并上調了抗凋亡因子Bcl-2的表達，從而改善神經功能。

自噬是一種在所有真核生物中高度保守的細胞降解和循環過程。動物實驗研究表明，自噬在腦I/R損傷后的中樞神經系統，特別是神經元中起著雙刃劍作用。在再灌注的最初幾小時，自噬通過溶酶體系統降解受損的細胞器和錯誤折疊的蛋白質，在腦I/R損傷中發揮保護作用。在再灌注后期，過度的自噬會過度降解具有正常功能的細胞器和蛋白質，最終導致自噬細胞死亡和細胞組織的繼發性損傷。已發表的數據顯示，腦I/R損傷后通過激活自噬相關蛋白LC3誘導自噬體的形成[5]。自噬體是一種含有受損細胞器或蛋白質的雙膜囊泡。自噬體與溶酶體融合后，進化為自噬溶酶體，即具有單層膜的囊泡。LC3誘導前自噬體結構的形成，促進自噬液泡的形成，使其成為自噬的標志物。已證實LC3以兩種形式存在，即LC3I(可溶性形式)和LC3-Ⅱ(膜結合形式)，并且LC3-Ⅱ富集于囊泡膜上，促進成熟自噬體的形成。此外，LC3-Ⅱ還通過與p62的C端結合參與自噬的降解。本研究表明，七氟醚處理后，自噬空泡的形成減少。此外，自噬相關蛋白LC3-Ⅱ的表達受到抑制，而p62蛋白水平升高，提示七氟醚的神經保護作用與抑制神經元自噬有關。

沉默信息調節因子1(SIRT1)是一種NAD依賴性脫乙酰酶，能夠通過脫乙酰化組蛋白調節炎癥反應、氧化應激、凋亡和自噬。之前研究表明，使用一種SIRT1抑制劑EX527對腦I/R損傷進行預處理，可以消除SIRT1的腦保護作用[6]。FOXO1是SIRT1的下游靶標，有報道稱，FOXO1在維持自噬降解活性和發育中神經元的形態成熟方面起著至關重要的作用。研究表明，NAD+依賴性蛋白去乙酰化酶SIRT1在抑制自噬和抑制細胞凋亡以及FOXO1通路的下游信號傳導中起關鍵作用[7]。在本研究中，七氟醚處理上調了SIRT1/FOXO1信號通路的活性，而EX527處理時，神經細胞凋亡和自噬水平增加。以上結果提示，SIRT1/FOXO1信號通路可能與七氟醚對海馬神經元的抗凋亡能力和抑制自噬有關。

綜上所述，本研究表明七氟醚可能通過抑制自噬對腦I/R損傷有神經保護作用，其機制與SIRT1/FOXO1信號通路有關。以上結果進一步揭示了七氟醚發揮神經保護作用的機制，并提示七氟醚治療腦I/R損傷可能是一種潛在的治療策略。