食管鱗狀細胞癌患者血清miR-1246、miR-146a表達水平與預后和細胞免疫功能的關系研究*

徐 超,徐 珊,竇 燕,閆玲新,閆 茹

河北省邯鄲市中心醫院消化科,河北邯鄲 056001

食管鱗狀細胞癌(ESCC)是食管癌最常見的組織學類型,是中國第四大惡性腫瘤,多數患者確診時已處于晚期,腫瘤惡性程度高,病死率高[1-2]。惡性腫瘤的發生與免疫失衡存在密切關系,免疫功能低下可導致腫瘤細胞逃避免疫監視和免疫細胞殺傷作用,引起腫瘤細胞惡性增殖、侵襲或轉移[3]。微小RNA(miR)是一種小型非編碼調控RNA 分子,轉錄后調控宿主基因表達,參與各種生物過程,包括腫瘤的發生、進展和轉移以及腫瘤免疫調節[4]。miR-1246 是一種由突變p53衍生的外泌體,可介導腫瘤細胞和巨噬細胞之間的通信傳導,對腫瘤相關巨噬細胞進行免疫調節,發揮免疫抑制作用和癌基因作用[5]。miR-146a是免疫反應的關鍵調控因子,可調節T 淋巴細胞增殖及其細胞因子表達,參與癌癥發展[6]。miR-1246、miR-146a是否參與ESCC腫瘤免疫調節尚不清楚,且miR-1246、miR-146a與ESCC患者預后關系的報道并不多見。本研究以此為切入點,擬探討血清miR-1246、miR-146a與ESCC 患者細胞免疫功能和預后的關系及其預測ESCC 患者預后的價值,旨在為臨床ESCC的個性化診療和預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年2月至2019年1月本院收治的91例ESCC患者為ESCC組,其中男47例,女44例;年齡53～71歲,平均(66.26±4.12)歲;腫瘤最大徑2～7 cm,平均(4.62±1.36)cm;腫瘤部位:頸段及胸上段42例,胸中段49例;分化程度:低中分化53例,高分化38例;TNM 分期:Ⅰ～Ⅱ期57例,Ⅲ期34例。TNM 分期參照文獻[7]。納入標準:(1)均進行胸腔鏡食管癌切除術和淋巴結清掃術,術后組織病理學檢查證實為ESCC;(2)采集血標本前未接受任何形式的治療;(3)臨床資料完整;(4)患者均知情且簽署同意書。排除標準:(1)合并其他部位惡性腫瘤、血液系統疾病;(2)壞死癌灶取材標本;(3)合并免疫系統疾病;(4)隨訪失訪者。另選擇同期于本院進行健康體檢的90例體檢健康者為對照組,男49例,女41例;年齡52～71歲,平均(65.97±4.13)歲。兩組年齡、性別比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究獲得本院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑和儀器 TRIzol試劑盒(美國Invitrogen 公司),M-MLV 逆轉錄酶(Epicentre 公司),CFX96 實時熒光PCR 儀(美國Bio-Rad 公司),RPM1-1640培養液(杭州吉諾生物醫藥技術有限公司),CD4單克隆抗體、CD8單克隆抗體(武漢艾美捷科技有限公司),羊抗兔IgG Alexa Fluor 488b 標記(上海富衡生物科技有限公司),EPICS-XL 流式細胞儀(美國COULTER 公司)。

1.3 方法

1.3.1 miR-1246、miR-146a檢測 ESCC 患者確診后未治療前以及對照組于體檢當日采集肘靜脈血3 mL,自然凝固后以3 000 r/min的速度離心10 min后取上清液,加入10 cm2/mL 比例TRIzol法提取總RNA。采用M-MLV 逆轉錄酶將RNA 逆轉錄為cDNA。取2 μL cDNA 樣品加入實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)體系,采用RT-qPCR 檢測miR-1246、miR-146a表達水平,反應條件:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸10 s,40個循環。引物由金唯智生物科技有限公司設計和合成,序列如下,miR-1246 上游:5'-CCU GCU CCA AAA AUC CAU U-3';下游:5'-UUG UAC UAC ACA AAA GUA CUG-3'。miR-146a上游:5'-CGG CGG TGA GAA CTG AAT TCC A-3';下游:5'-GTG CAG GGT CCG AGG T-3'。GADPH 上游:5'-TGA CGT GCC GCC TGG AGA AAC-3';下游:5'-CCG GGC ATC GAA GGT GGA AGA G-3'。采用熔解曲線分析法進行RT-qPCR 后產物分析,共做3次平行試驗。以GADPH 為內參,2-ΔΔCt計算miR-1246、miR-146a在各組相對表達量。

1.3.2 細胞免疫功能檢測 ESCC 患者于確診后未治療前,對照組于體檢當日采集清晨空腹靜脈血3 mL注于抗凝試管,經EDTA 抗凝后稀釋,加入100 μL RPM1-1640培養液混勻,置入含5%CO2培養箱內37 ℃溫度下培養5 h。取出后加入CD4-PerCP單克隆抗體、CD8-PerCP單克隆抗體,室溫避光孵育30 min,加入2 mL紅細胞lysis Buffer混勻后室溫下避光孵育10 min,以3 000 r/min的速度離心5 min,棄上清液,2 mL 磷酸鹽緩沖液洗滌,再次離心洗滌,加入500 μL磷酸鹽緩沖液重懸細胞,制成外周血單個核細胞液懸液,密度至1×104個/毫升。流式細胞儀檢測T 淋巴細胞亞群CD4+、CD8+占比,計算CD4+/CD8+比值。CD4+/CD8+參考值為1.3～2.0[8],低于參考值下限為CD4+/CD8+降低。

1.4 隨訪 所有患者定期電話或微信隨訪,中位隨訪時間為24(12～36)個月,隨訪截止時間為2020年2月,統計隨訪期間生存情況。生存時間定義為確診日期到死亡或隨訪結束日期。

1.5 統計學處理 采用SPSS25.0統計軟件進行數據分析。計量資料經K-S檢驗符合正態分布,以表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。采用Pearson 相關分析 miR-1246、miR-146a 表達水平與CD4+/CD8+相關性,Kaplan-Meier法繪制不同miR-1246、miR-146a 表達水平下ESCC 患者生存曲線,Log-Rank 檢驗生存率的差異。受試者工作特征(ROC)曲線分析miR-1246、miR-146a預測ESCC 患者預后的價值,預后不良定義為隨訪期間死亡。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-1246、miR-146a表達水平對比ESCC組血清miR-1246 表達水平高于對照組,差異有統計學意義(P<0.001),miR-146a表達水平低于對照組,差異有統計學意義(P<0.001),見表1。

表1 ESCC組與對照組miR-1246、miR-146a表達水平差異()

表1 ESCC組與對照組miR-1246、miR-146a表達水平差異()

2.2 不同臨床病理特征、細胞免疫功能ESCC 患者血清miR-1246、miR-146a表達水平比較 TNM 分期為Ⅲ期、CD4+/CD8+降低患者血清miR-1246表達水平高于TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期、CD4+/CD8+正常患者,差異有統計學意義(P<0.001),miR-146a表達水平低于TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期、CD4+/CD8+正常患者,差異有統計學意義(P<0.001);不同年齡、性別、腫瘤最大徑、腫瘤部位、分化程度患者miR-1246、miR-146a表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 不同臨床病理特征、細胞免疫功能ESCC患者血清miR-1246、miR-146a表達水平的比較()

表2 不同臨床病理特征、細胞免疫功能ESCC患者血清miR-1246、miR-146a表達水平的比較()

2.3 血清miR-1246、miR-146a表達水平與CD4+/CD8+相關性分析 miR-1246 表達水平與CD4+/CD8+呈負相關(r=-0.752,P<0.05),miR-146a表達水平與CD4+/CD8+呈正相關(r=0.775,P<0.05),miR-1246、miR-146a表達水平之間呈負相關(r=-0.801,P<0.05)。

2.4 不同miR-1246、miR-146a表達水平ESCC患者預后比較 隨訪期間,ESCC 患者中43例(47.25%)存活,48 例(52.75%)死亡。根據miR-1246、miR-146a表達水平的均值將患者分為高miR-1246表達組(miR-1246≥1.52,47例)、高miR-146a表達組(miR-146a≥0.39,42 例)、低miR-1246 表達組(miR-1246<1.52,44 例)、低 miR-146a 表達組(miR-146a<0.39,49例)。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示高miR-1246表達組、低miR-146a表達組患者生存率分別為31.91%(15/47)、36.73%(18/49),低于低 miR-1246 表達組、高 miR-146a 表達組的63.64%(28/44)、59.52%(25/42),差異有統計學意義(χ2=9.683、4.384,P=0.002、0.036),見圖1。

圖1 不同miR-1246、miR-146a表達水平ESCC患者的生存曲線

2.5 miR-1246、miR-146a預測ESCC 患者預后的價值分析 ROC曲線分析miR-1246、miR-146a單獨檢測預測ESCC患者預后的截斷值為1.12、0.49,曲線下面積(AUC)分別為0.754、0.713,靈敏度分別為75.00%、72.20%,特異度分別為76.40%、70.40%,約登指數分別為0.514 0、0.426 0,miR-1246、miR-146a聯合檢測預測ESCC 患者預后的AUC 為0.824,靈敏度為81.70%,特異度為80.20%,約登指數為0.629 0,均高于miR-1246、miR-146a單獨預測。見表3和圖2。

表3 miR-1246、miR-146a單獨和聯合檢測預測ESCC患者預后效能

圖2 miR-1246、miR-146a單獨和聯合檢測預測ESCC患者預后的ROC曲線

3 討論

免疫系統是人體最重要的防御系統,在調節腫瘤生長過程中起著重要的作用,如果免疫系統受到抑制,腫瘤細胞可逃避免疫監視,發生免疫逃逸,導致腫瘤惡性增殖、侵襲和轉移[9]。T 淋巴細胞是免疫細胞中最重要的組成部分,在維持機體免疫功能、殺傷腫瘤細胞方面發揮重要作用,ESCC 患者T 淋巴細胞亞群平衡存在異常[10]。miR 是一類非編碼小分子RNA,通過特異性識別靶mRNA3' 非編碼區降解靶mRNA、抑制mRNA 翻譯,在轉錄后調控多種基因表達,參與細胞生長分化、免疫調節、腫瘤發生和進展等過程[11]。

本研究發現miR-1246 在ESCC 血清中表達上調,TNM 分期為Ⅲ期的患者miR-1246表達水平高于TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期患者,說明miR-1246 表達與ESCC患者TNM 分期有關。丁元杰等[12]篩選ESCC差異表達miR,發現miR-1246存在明顯表達異常,與ESCC發生、發展有關。另有研究顯示糖原合成酶激酶3β是關鍵絲/蘇氨酸蛋白激酶,通過作用于Wnt/β-鏈蛋白、磷酸肌醇-3 激酶/蛋白激酶B、Hedgehog信號通路調節細胞增殖分化、存活和凋亡,miR-1246直接靶向調控糖原合成酶激酶3β促進食管癌轉移[13]。本研究中miR-1246在CD4+/CD8+降低患者中表達水平升高,miR-1246與CD4+/CD8+呈負相關,說明miR-1246過表達可抑制T 淋巴細胞功能,降低抗腫瘤免疫反應,提示miR-1246可能通過調控腫瘤免疫,促使腫瘤細胞逃逸導致腫瘤進展。COOKS等[5]報道顯示miR-1246作為p53家族的一個靶點,可促使腫瘤相關巨噬細胞招募外周血單核細胞,抑制腫瘤免疫微環境,促使腫瘤進展。

本研究發現miR-146a表達缺失與ESCC 惡性侵襲轉移行為有關,miR-146a表達水平與CD4+/CD8+呈正相關,提示miR-146a缺失可能抑制T 淋巴細胞增殖分化,降低對腫瘤細胞的殺傷力,提高腫瘤進展的風險。miR-146a是免疫應答的重要調節因子,通過抑制輔助性T 細胞分化所需的轉錄激活因子1,抑制干擾素-γ介導的輔助性T 細胞應答,對輔助性T 細胞發揮負調控作用[14],miR-146a還可調節腫瘤細胞增殖凋亡、新生血管形成,介導腫瘤細胞與巨噬細胞信號轉導,改變腫瘤微環境[15-16]。MASTROIANNI等[17]研究結果顯示miR-146a通過信號轉導與轉錄激活因子1/干擾素-γ 軸影響程序性細胞死亡受體1水平,程序性細胞死亡受體1是適應性和先天免疫應答的抑制劑,可誘導腫瘤反應性細胞毒性T 細胞功能衰竭,參與腫瘤細胞的免疫逃逸。本研究發現miR-1246與miR-146a表達水平呈負相關,提示兩者可能在ESCC發病中發揮相互抑制作用,破壞腫瘤免疫微環境,抑制機體抗腫瘤免疫反應,促使癌癥進展。

通過隨訪發現miR-1246高表達、miR-146a低表達與ESCC 患者低生存率有關,miR-1246、miR-146a聯合檢測預測ESCC 患者預后具有較高效能,提示miR-1246、miR-146a可能成為ESCC 患者預后評估的輔助指標,二者聯合檢測可為ESCC 患者預后評估提供更可靠的參考。

綜上所述,miR-1246、miR-146a均參與ESCC 發病和腫瘤免疫調節過程,因此本研究選擇miR-1246、miR-146a兩者指標進行探討分析,結果發現miR-1246與miR-146a可能相互抑制調控腫瘤免疫反應參與ESCC 進展和不良預后。miR-1246、miR-146a聯合檢測可作為ESCC患者預后評估的輔助手段。