植物基因克隆研究進程分析

李卓雨

摘? ? 要：隨著科學技術的發展及人類基因工作的推進，植物基因克隆技術研究取得了一定的成就。近年來，我國植物基因克隆技術有了新發展，玉米、小麥及水稻等均克隆了較多與植物產品品質、產量等相關的基因。就植物基因克隆技術展開研究，以供借鑒。

關鍵詞：植物;基因;克隆技術

文章編號：1005-2690（2022）03-0010-03? ? ? ?中國圖書分類號：S336? ? ? ?文獻標志碼：B

植物基因克隆技術是現代生命科學的關鍵組成，也是現代生命科學技術最為關鍵的要素，基于20世紀70年代初級DNA體外重組技術的誕生，經歷了甄別、分離特異性的基因并得到基因完整的序列，明確其在染色體上的確切位置，闡明其生化功能，以及結合生物工程方式應用于生產實踐中的過程[1]。

通常基因克隆策略包含兩類，即正向遺傳學方式和反向遺傳學方式。前者主要以待克隆基因所表現出的功能為前提，基于對包括基因表達產物及其表現現狀實現克隆，包含了功能方面以及表觀方面等多個部分;后者更多綜合基因自有的序列或基因組之中的特殊點位進行克隆，如定位克隆和同源序列法克隆等。隨著DNA測序和生物信息學等理念不斷完善，電子克隆等新興技術誕生[2]。

目前，包括煙草在內的多類植株已在品質、抗性以及性狀等多個維度實現了克隆。對植株基因克隆涉及的相關技術進行分析，可以更好地了解植物基因克隆技術的發展過程，并對其未來發展趨勢進行展望。

1 功能克隆技術

功能克隆是以蛋白質的功能為基礎進行的基因克隆，主要內容是綜合確切的生化問題或已知與這一功能存在關聯性的蛋白質，對純化蛋白進行分離，測定出相關氨基酸序列，結合遺傳密碼研究明確潛在的編碼序列，開發出相關的核苷酸探針、雜交篩選基因組文庫等，基于抗原反應鎖定特異克隆，完成測序處理，繼而獲得對應的序列。結合該形式克隆基因的核心分離得到純蛋白，得到其部分序列以及相關抗體，隨后搭建基因組文庫，并結合文庫予以篩選[3]。相關學者結合該方式，自擬南芥中克隆到一個解毒外運載體蛋白基因AtDTX1的同時，也發現了一個涵蓋不少于56個編碼相關蛋白基因的基因家族。

隨著科研深入以及配套技術不斷完善，越來越多的蛋白質得以有效純化，這勢必會為克隆技術提供更為全面與完善的環境基礎，不斷提升功能克隆的效用價值，并在市場上推廣[4]。

2 定位克隆技術

定位克隆技術的核心是通過目標基因在染色體之中的點位實現基因克隆的方式，對于克隆編碼產物基因不明確的基因更為適用[5]。

定位克隆技術的原理主要為結合功能基因于基因組中較為穩定的基因座，基于分子標記模式對其實施精準定位，選擇和目標基因兩端聯系緊密的分子標記篩選帶有較大片斷的基因組文庫，結合獲得的陽性克隆形成基因區，利用染色體步行，穩步挨近候選區的方式，得到帶有目標基因的大片段克隆，對于這一目標基因片段實施亞克隆，或是利用這一克隆作為探針得到基因組文庫，以實現目標基因精確值小片段區間內完成序列的研究，利用遺傳轉化以及功能互補測試研究，對提取的目標基因進行判斷。

植物方面的應用主要包括水稻、番茄、大麥以及馬鈴薯等植株，目前均已提取了數十個關鍵的基因，其中抗病基因的克隆較多，典型的包括馬鈴薯的Gpa2基因以及水稻的Xa1基因等。近年來，中國科學院等多個團隊結合定位克隆技術先后提取并改良了水稻遺傳技術，對水稻株高、抽穗期以及水稻的秈粳不育等核心基因進行了調控，同時實現了對花期及關聯生長情況的RID1基因等實施可靠管控，在水稻功能基因領域積累了諸多經驗。

3 抑制性消減雜交技術

抑制性消減雜交技術以DNA消減雜交方式及抑制聚合酶鏈式反應（PCR）為基礎，并以此獲得高品質及快捷的分離基因。其中，PCR是一種能夠對特定DNA片段擴增放大的分子生物技術，通常可以把其視為生物外體所具有的特殊DNA復制，其最大的特征是能夠大幅增加微量的DNA。

抑制性消減雜交模式綜合了抑制PCR的高效動力學和消減雜交策略。后者以雜交二級動力學原理為基礎。前者則主要圍繞鏈內退火好于鏈間退火的特性，推動不是目標序列的兩側實現反向重復，繼而退火過程中誘發諸如“發卡”的結構模式，無法當作模板以及引物匹配，繼而選擇性地抑制非目標的基因片段發展。由此不僅有效應用了差減雜交技術的消減富集，也很好地涉及了PCR技術開展高效能的動力學富集[6]。

抑制性消減雜交技術的優勢如下。

第一，較高的特異性，樣品通過兩次消減雜交，使差異基因富集，又經抑制PCR增加了差異基因，致使特異性提升，同時假陽性率顯著降低。

第二，有較高的靈敏性，對于分離體量不高的基因有突出優勢。基于使用均等化的設計方式，促使含量不一的單鏈DNA分子含量趨同，有利于低含量單鏈DNA分子的甄選。

第三，能夠開展大面域的基因篩選，該技術1次可同時分隔得到數百個差異基因。

第四，操作方式較為便捷，有助于掌握，該技術只要求開展兩次雜交、兩次PCR，無須移出雜交復合體，接頭的設計也相對簡便，無須頻繁更換和移出接頭。

第五，篩選周期不長，結合SSH（安全外殼協議）通常僅3～4 d即可得到差異基因。

此外，抑制性消減雜交技術也存在一定的不足，比如訴求的起始mRNA（信使核糖核酸，由DNA的其中一條鏈作為模板轉錄而來，并攜帶有遺傳信息，繼而指導蛋白質合成的一類單鏈核酸）過大。如若mRNA的量不足，兩次差減之后有部分關鍵、低豐度表達差異cDNA（互補脫氧核糖核酸，和mRNA鏈具有互補的單鏈DNA，并以mRNA為模板）片段或許無法檢測得到，其次單次抑制性消減雜交反應只可以對比兩個mRNA池，不適宜分析多個原料以及處理彼此間的不同。

現階段，該技術在植物方面的使用主要包含兩個層面。一是植株生長發育和組織特異性方面的分析，包括辣椒素的生物合成有關基因的分割、甜菜根表達基因的分割以及甄別;水稻幼穗發育初期特異性表達基因的分割、胡蘿卜色體細胞培根發育有關基因的分割;二是生物和非生物逆境和植株關聯性以及引發基因差異性表達研究，例如鋁離子脅迫優勢甘蔗基因的差異性表達等。

4 同源序列法

與傳統克隆方式不同，同源序列法的基因克隆主要針對的是與待克隆基因同源的已知序列，且具備較大的優越性。當前，很多植株基因序列已經掌握，在對類似基因進行克隆時，需從對應的庫內檢索得到關聯基因序列，設計出特異引物;模板設定為植物基因組DNA或cDNA，利用PCR等方式完成基因的擴增操作，之后引入純化工藝，與契合的載體連接，開展序列研究，對比論證以及明確目標基因克隆。這是在PCR技術出現以來而研發出的一種相對快捷、簡易的克隆植物基因的辦法，RGAs也屬于該技術范疇。

雖然抗病基因病原物種類型存在差異性，但此類抗病基因產物有著極為相似的結構域，包括NBS（N-溴代琥珀酰亞胺）、LRR（氨基酸序列）、STK（種抑癌基因，編碼一種絲蘇氨酸蛋白激酶）等。結合此類保守結構域特點，設計特有異性的簡并引物，基于植物總DNA以及cDNA為模板開展PCR擴增，由此獲得抗病基因候選片段，結合分析檢驗，確定目的基因克隆[7]。

5 基因芯片技術

基因芯片即DNA芯片，為常規的生物芯片之一。基因芯片技術是以探針技術雜交測序技術為基礎形成的一類更具高效性的便捷核算研究模式。多個探針片段按照特定的秩序固化于支持物表面的形式，組成DNA探針陣列，之后和標記的試樣雜交，結合檢測雜交參量完成對于目標物高效、并行的檢測。與其他克隆技術形式對比，該技術的核心特質是微型化。芯片每1 cm2固定安置了10 000個DNA序列，即上萬個基因，僅利用1次分析過程就可以清晰地獲得上萬個表達數據。微型化的另外一個特質是對樣品及試劑使用情況進行微量化管控，選擇納克等級的mRNA以及相關雜交液等即可研究大批量的基因數據，這是其他表達技術無可比擬的。在芯片的研發生產等方面均支持自動化形式，雜交、洗片等流程均可完成自動化，工作效能全面提升。

基因芯片技術在植物基因克隆方面的應用較為普遍，比如在研究生物體對于逆境的反應方面，通過芯片技術能夠實現更為便捷、有效地分析基因的差異性表達。

趙寶存及其團隊結合基因芯片分析了小麥于各個鹽脅迫環境下的根位置基因的應答表現，共得到了61 215個小麥基因差異性表達圖譜，并完成了不同鹽脅迫情況下根部基因表達的明顯變化。和對照組對比，鹽脅迫1 h的試樣內，5.6個百分點的基因上調表達，12.4個百分點的基因下調表達，80.9個百分點未有變化;鹽脅迫6 h試樣內，上調表達、下調表達以及未有變化的基因分別占比6.8個百分點、9.6個百分點以及82.7個百分點。

基因芯片技術在基因表達水平領域也得到了一定的普及。將已然明確了的基因置入芯片內，對其mRNA進行反轉錄處理，得到cDNA，對應性地開展熒光標記處理，之后與芯片實施雜交，通過雜交信號等強度情況來明確具體的表達豐度指標數據，結合基因芯片對表達水平進行分析，通過自主、高效分析得到數萬個基因的表達情況。

Bevan通過擬南芥基因組內的45個cDNA，分析得到了該植物根、葉等位置的基因表達信息，對不同熒光劑的標記逆轉錄研究分析后實現同該陣列的有效雜交研究，在激光共聚顯微鏡技術的支持下，了解并掌握了植株的根部位置及其他位置等存在的26個基因表達特點及不同之處，參與葉綠素合成的CAB1基因在葉組織比根組織表達高出500倍。

高志勇及其團隊基于基因芯片分析了水稻孕穗期不同器官基因表現，最終得到了主控花的形態組成MADS2box基因家族中的相關基因，于水稻的孕穗期階段在葉和根中得到強烈表達。該基因在葉位置進行表達，也反映了NAC（乙酰半胱氨酸）之中的Zinc（鋅）和EST（鉀）等都出現了在幼穗之中的可靠基因表達情況，這證明了水稻花類似的基因已遠優于花發育ABC（向前葉片概念）機制下的MADS2box基因。此類發現進一步擴展了對Zinc及EST等基因在植株內生長發育效用的認知，也為該領域后期全面性研究工作的開展打下了重要基礎。

此外，基因芯片技術在轉基因產品檢驗領域有較好的效用。搜集關于轉基因技術的啟動子、目的基因以及標記基因的多個基因序列信息，得到基因芯片，可對轉基因農產品展開研究。Suzuki及其團隊選擇寡聚核苷酸序列展開研究，綜合芯片技術確定了353個VP1/ABA控制基因。此類基因分布在73%的植株組織內，且VP1以及ABA存在聯系，由此反映了ABA信號傳達以及VP1功用彼此的聯系。周萍萍等（2008）[8]參照大豆中的外緣基因，篩選得到了有關啟動子，綜合其內源基因當作內參照基因得到了目標引物和對應的探針，利用多重PCR技術完成了樣品核酸擴展以及配套的熒光標記管理，將PCR產物和對應的基因芯片雜交，研究轉基因含量不同情況下的RRS標準參照物，其靈敏性指標可達到0.45%。

6 電子克隆技術

電子克隆技術即計算機雜交技術，主要以數學算法為核心，強調計算機、互聯網等方式對已有的基因序列、EST等生物學測試編碼和功能驗證的基因手段。電子克隆技術的主要流程如下。

第一步，綜合目標基因和同源基因EST當作是搜索序列，確定BLASTN（序列比對分析），搜索對應的EST庫未有研究或是得到起始檢索的片段有著同源性和部分重合的序列，長度大于100 bp。

第二步，分析得到的序列組裝成重疊群，綜合這一重疊群作為檢測序列，反復開展BLAST檢索，并確保序列充足，進一步擴展重疊群，循環這一流程，直到不出現新的EST序列，最終獲得cDNA。

第三步，將該cDNA和相關數據庫進行相似度對比分析，假設不存在精準匹配基因情況，將這一序列數據通過EST序列6類閱讀框轉化為蛋白質形式，隨后和蛋白質序信息庫對比。

基因研究結果為3類，一是已知基因為人類已然甄別以及掌握的基因;二是位置基因，此類基因彼此并無同種以及異種基因匹配，之前未有鑒定新基因;三是新基因以及未知基因予以生物學的分析，由此綜合獲得基因序列得到引物，引入PCR模式獲得基因組的序列數據，隨后深入開展功能分析，于電子克隆的前提下，結合IMAGE協議得到對應的免費克隆，有效避免了篩選全長基因的制約，加強基因功能方面的研究。

電子克隆的應用獲取明確的數據資源，結合ESTs序列，利用同源篩查得到基因系列及全長的cDNA序列，大大削減了搭建及篩選cDNA文庫等頻繁的試驗活動，進一步加快基因克隆。和以往的實驗室方式對比，電子克隆技術更為快捷、高效、成本更低。基于多類模式生物基因測序工作，和各個生物EST數據庫構建以及完善，電子克隆勢必會對基因克隆起到重要作用，也必定加速新基因等發展及克隆技術發展。

7 植物克隆技術發展趨勢

生物基因猶如汪洋，在基因克隆方面人類已然邁出了堅定的步伐，但要想切實掌握該技術，基因克隆工作任重道遠。展望未來，基因克隆技術將會朝著以下方向發展。

第一，高通量、高效能及更經濟性的方向，SSH（安全外殼協議）技術以及基因芯片技術等為未來發展主流方向之一。

第二，全基因組測序的方向，擬南芥以及水稻等基因測序已然完成，勢必會對更多植株進行全基因組測序，比如玉米以及柑橘等。

第三，分析更多功能基因彼此的調控網絡。高速發展及持續完善的高通量基因克隆技術，包括芯片技術等在短期內實現對諸多基因團的表達分析，可以對植株功能整體層面的基團作用機理進行深層次剖析，繼而把對基因調控效用的認知從單個基因提升到多基因網絡層面上。對有關分析數據進行綜合統籌，從而系統性地認識功能基因的調控網絡，有利于從更多層面利用功能基因開展植物基因工程改良。

8 結束語

一直以來，生命科學研究人員創造了多類植物基因克隆方式，各種方式有著不同的特色，也存在不同的問題。未來，隨著技術的發展以及社會關注的不斷提升，生命科學研究必將迎來新的廣闊空間，實現更好的發展。

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