LC-MS定量研究白樺脂酸的體外細胞攝取與轉運

陳 旺， 王美慧， 帥麗霞， 詹 雁， 譚 鐳， 阮 佳， 徐超群

(1. 四川省中醫藥科學院，四川 成都 610041; 2. 成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137)

0 引 言

白樺脂酸 (betulinic acid，BA)是廣泛存在于自然界的一種五環三萜類有機酸，研究發現馬甲子[1-2]、酸棗仁[3-4]、白樺樹[5-6]等多種植物中存在BA。BA具有廣泛的抗腫瘤活性，對黑素瘤[7]、腦膠質瘤[8]、胃癌[9]、肺癌[10]、肝癌[11]等多種腫瘤細胞具有較高的細胞毒性，是對正常細胞毒性的5～7倍[12]，尤其對黑素瘤細胞有選擇殺傷作用而不殺傷健康細胞。此外，BA在抗炎[13]、抗菌[14]等方面均表現出良好的活性。但其水溶性差[15]，口服生物利用低[16]，這不僅限制了BA在臨床的應用，對于其含量測定方法要求更高。目前，測定BA的常用方法是高效液相色譜法（HPLC）[17-19]，但是HPLC靈敏度較低，無法滿足生物樣品中BA的微量檢測。Caco-2細胞系來源于人結腸腺癌細胞，可在培養過程中自發形成具有與小腸上皮細胞相似的微絨毛和緊密連接的單細胞層，Caco-2細胞不僅在形態、生化特征與人小腸相似，還具有相似的轉運體、代謝酶以及滲透特性[20]，研究BA在Caco-2細胞的吸收和轉運機理有助于揭示BA在腸吸收機制。本文采用液相色譜-質譜聯用（LC-MS）技術，首次建立了BA在細胞中的含量測定方法，并對其方法學進行考察；通過細胞培養技術建立Caco-2細胞模型，并通過細胞形態特征、跨膜電阻值等指標篩選出可用模型，分別用于攝取和轉運實驗，測定細胞中BA含量，研究其攝取和轉運特性，并考察轉運體抑制劑維拉帕米和丙磺舒對其轉運和攝取的影響。本實驗首次建立了細胞樣品中BA含量的LC-MS分析方法，能準確在細胞水平測定BA含量，可為其在Caco-2細胞的吸收和轉運研究提供可靠分析方法。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

BA（純度≥98%，成都普瑞法科技開發有限公司，PRF10122722）；BA對照品（中國食品藥品檢定研究院，111802-201703）；齊墩果酸（中國藥物生物制品檢定所，110709-200304）；甲醇（色譜純，Fisher）；其他試劑為分析醇，純凈水為怡寶純凈水。

1.2 儀器

1290高效液相色譜儀（Agilent，USA）；6460 Triple Quad LC/MS（ Agilent， USA） ； AC2-4S1 AirsteamII級 A2型生物安全柜（ESCO，Singapore）；CO2培養箱（ESCO，Singapore）；S40-SLIDER倒置光學顯微鏡（Leica Portugal，Germany）；Varioskan LUX 酶標儀（Thermo Scientific，USA）；L2-6K 臺式低速離心機（湖南可成儀器設備有限公司，中國）；細胞計數儀（Invitrogen）；MERS00002細胞電阻儀（Millicell，USA）；XS205 DualRange型分析天平(Mettler Toledo公司，瑞士)；真空干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司，中國）；3K15低溫高速離心機（Sigma，Germany）；T25細胞培養瓶（NEST）；96孔板（NEST）；細胞小室 Transwell培養板（Corning Inc，USA，12孔聚碳酸酯膜，孔徑 0.4 μm）。

2 方 法

2.1 細胞轉運

將Caco-2細胞接種于Transwell板中，按照常規培養條件和方法[21]培養20～22 d，測定計算其跨膜電阻值（TEER）以檢測細胞膜的完整性，取TEER值大于450 Ω·cm2的孔，按跨膜轉運實驗要求[21]處理后進行藥物跨膜轉運實驗，于實驗后測定計算各孔TEER值，舍棄TEER值小于450 Ω·cm2的孔。

2.2 細胞攝取

取生長至對數期的Caco-2細胞，按攝取培養要求[22]處理后進行細胞攝取實驗，以考馬斯亮藍法定量樣品中蛋白含量，LC-MS定量樣品中BA含量，結果以每毫克蛋白質藥物攝取量（μg/mg）表示。

2.3 色譜質譜條件

色譜柱Agilent SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），柱溫 35 ℃，流動相 0.1% 甲酸水-甲醇（22∶78，v/v），流量0.3 mL/min，進樣量1 μL；檢測模式：電噴霧離子化（ESI），采用選擇性負離子檢測方式，檢測離子為 BA和齊墩果酸（m/z均為455.4），噴霧壓力：40 psi（1 psi=6.895 kPa），干燥器流量：10 L/min，干燥器溫度：350 ℃，檢測電壓：4 000 V。切入時間6 min，切出時間12 min。

2.4 溶液的制備

2.4.1 對照品和內標溶液制備

稱取BA對照品8.40 mg，置于100 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成質量濃度84 μg/mL的BA儲備液，-20 ℃儲藏備用。使用時稀釋成適當濃度的對照品工作液。稱取齊墩果酸對照品9.60 mg，置于100 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成質量濃度96 μg/mL的齊墩果酸儲備液，-20 ℃儲藏備用。使用時稀釋成終濃度為9.6 μg/mL的內標工作液。

2.4.2 空白細胞液制備

分別用HBSS緩沖液（含3%的泊洛沙姆188）和雙蒸水孵育Caco-2細胞2 h即得。

2.4.3 對照與質控樣品制備

取BA儲備液，用甲醇稀釋配制成質量濃度為8.4，16.8，33.6，84，168，252，504，840 ng/mL 系列溶液，取上述稀釋溶液200 μL，50 ℃氮氣吹干后再分別加入等體積的空白細胞液，混勻得對照品溶液，另取33.6，168，504 ng/mL BA溶液同法操作制得質控樣品。

2.4.4 樣品前處理方法

取200 μL細胞懸液樣品于10 mL的離心管中，先加入 5 μL 內標的齊墩果酸（9.6 μg/mL），混勻后加入2 mL乙酸乙酯，渦旋15 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液50 ℃氮氣吹干，殘渣加入200 μL甲醇溶液復溶，渦旋5 min，13 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液進樣，LC-MS測定。

2.5 統計學分析

本實驗數據統計分析采用SPSS 21. 0，繪制作圖采用GraphPad Prism 7.0統計軟件，數據結果以平均值±標準差() 表示。用單因素方差分析比較多組之間的差異，*P＜0.05為有統計學差異，**P＜0.01為具有顯著性差異。

3 結 果

3.1 方法學考察

3.1.1 專屬性

取細胞攝取陰性溶液、細胞攝取供試品溶液、細胞轉運陰性溶液、細胞轉運供試品溶液以及混合對照品溶液，在本實驗的LC-MS條件下分析，BA和內標齊墩果酸的保留時間分別為7.7 min和8.8 min，細胞中內源性物質不會對待測成分產生干擾，峰形良好，見圖1。

圖1 細胞攝取陰性溶液（A）、細胞攝取供試品溶液（B）、細胞轉運陰性溶液（C）、細胞轉運供試品溶液（D）、混合對照品溶液（E）LC-MS圖（1：BA；2：內標）

3.1.2 標準曲線與定量下限

精密吸取“2.4.3”項下的不同濃度的對照品溶液，按照“2.4.4”項下方法處理，進行LC-MS分析。采用加權最小二乘法（1/C），以BA峰面積與內標峰面積的比值(Y)和進樣濃度（X）進行線性回歸方程，計算標準曲線。攝取實驗和轉運實驗的標準曲線方程分別為Y=0.007X+0.131(r=0.997)，Y=0.007X+0.071(r=0.998)，線性范圍為 8.4～840 ng/mL，線性關系良好。

3.1.3 精密度與準確度

取“2.4.3”項下的 BA 質控樣品，按照“2.4.4”項下方法處理，每個濃度平行6份，分別于第1天和第5天測定，計算日內精密度、日間精密度，以實測濃度和真實濃度相比得回收率表示準確度。實驗結果顯示BA和內標的日內、日間精密度 RSD 為3%～10%，回收率為 95%～110%，均符合生物樣品分析的方法要求 （如表1所示）。

表1 精密度和準確度（n=6）

3.1.4 基質效應和提取回收率

取空白細胞液，不加內標按照“2.4.4”項下方法處理后向殘留物中加入200 μL濃度為504，168，33.6 ng/mL BA溶液和5 μL內標溶液，50 ℃氮吹干燥后200 μL甲醇復溶，進樣測定得峰面積A；取BA質控樣品按“2.4.4”項下方法處理后進樣測定得峰面積B；取 200 μL 濃度為 504，168，33.6 ng/mL BA溶液和5 μL內標溶液，50 ℃氮吹干燥后200 μL甲醇復溶后進樣測定得峰面積C，每個濃度平行6個樣品，基質效應=峰面積A/峰面積C×100%，提取回收率=峰面積B/峰面積A×100%。BA的基質效應及提取回收率分別在107.9%～114.5%和97.2%～103.0%范圍內，RSD均＜10%，符合生物樣品分析要求（如表2所示）。

表2 基質效應和提取回收率（±S ，n=6）

表2 基質效應和提取回收率（±S ，n=6）

項目 樣品 質量濃度/（ng·mL-1）基質效應/%RSD/%提取回收率/%RSD/%細胞攝取 BA 504 109.6±3.16 5.50 97.2±0.46 9.03 168 107.9±1.32 6.08 98.4±1.35 6.97 33.6 114.5±2.33 9.54 100.6±1.80 7.76齊墩果酸 240 110.7±2.70 7.92 96.6±0.94 7.98細胞轉運 BA 504 108.7±2.59 3.25 100.1±1.07 4.56 168 108.1±1.72 6.98 100.8±4.91 7.32 33.6 114.3±3.46 7.12 103.0±3.08 6.83齊墩果酸 240 108.7±2.14 8.46 101.3±1.10 5.64

3.1.5 穩定性

取“2.4.3”項下的BA溶液質控樣品，每個濃度樣品平行6份，分別考察BA質控樣品的室溫穩定性（25 ℃，24 h）、長期穩定性（-80 ℃ 冰箱放置30 d）、凍融穩定性（-80 ℃，反復凍融循環 3 次），以當日標準曲線計算質控樣品濃度，并計算準確度，結果見表3、圖2、圖3。結果顯示上述條件下RSD值均＜10%，表明BA質控樣品溶液均能在上述條件下保持穩定。

表3 穩定性（±S ，n=6）

表3 穩定性（±S ，n=6）

BA質量濃度/（ng·mL-1）率/% RSD/% 回收室溫穩定性 長期穩定性 凍融穩定性回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/%504 115.0±2.11 5.98 113.5±5.76 4.07 107.3±4.57 3.53 168 108.3±3.80 7.34 97.6±5.12 7.86 98.4±3.21 2.74 33.6 102.4±3.25 4.78 99.4±6.23 5.18 103.2±3.84 8.48

圖2 長期穩定性

圖3 凍融穩定性

3.2 實驗結果

3.2.1 細胞攝取

將 Caco-2細胞分別與 100，175，250 μg/mL BA供試液以及250 μg/mL BA供試液與維拉帕米、丙磺舒的混合試液培養，結果見圖4。BA攝取量隨著濃度的增加而增大，呈一定濃度依賴性（P＜0.05）。加入維拉帕米、丙磺舒共培養，BA攝取量與未加藥物的對照組比較，沒有顯著差異（P＞0.05），說明BA的攝取不受維拉帕米和丙磺舒的影響。

圖4 Caco-2細胞藥物攝取實驗

3.2.2 藥物跨膜轉運

不同濃度BA跨膜轉運實驗結果如圖5、圖6所示，AP→BL 時，BA 的Papp值為 1.31×10-7～1.40×10-7cm/s；BL→AP 時，BA 的Papp值為 1.50×10-7～1.61×10-7cm/s。兩側的Papp值均隨濃度的增加變化不大（P＞0.05），且外排率均＜1.5。在加入維拉帕米、丙磺舒轉運體抑制劑之后，BA的Papp值與未加入轉運體抑制劑的對照組相比，沒有顯著性差異（P＞0.05），表明BA的轉運不受轉運體抑制劑的影響。

圖5 Caco-2細胞藥物在AP→BL側轉運實驗

圖6 Caco-2細胞藥物在BL→AP側轉運實驗

4 討 論

前期，有學者[21]也采用LC-MS建立起BA的含量測定方法，但主要是針對大鼠血漿中BA的含量測定，而在本研究中主要是針對于HBSS細胞攝取液和轉運液樣品中BA的含量測定。實驗前期考察發現BA的HPLC檢測定量限約為4 μg/mL，而樣品中BA濃度遠低于HPLC定量限，故研究選用采用LC-ESI-MS檢測BA含量，并對其方法學進行了驗證，該方法測得的目標成分的內源性雜質干擾小，峰形對稱，分離度好，是一種較為快速、高效、靈敏的含量測定方法。

通過建立靈敏度高、特異性強的細胞攝取液和轉運液中BA濃度的LC-MS測定方法，設置不同濃度以及相同濃度下不同轉運蛋白抑制劑等考察因素，探究BA在Caco-2細胞中的攝取和跨膜轉運情況。攝取實驗結果表明，BA攝取存在濃度依賴性，轉運蛋白抑制劑維拉帕米和丙磺舒的加入對BA的單位蛋白攝取量無顯著影響；在轉運實驗中，100，175，250 μg/mL的BA從AP側到BL側及BL側到AP側的Papp值隨濃度的增加無顯著變化，而且ER＜1.5。可以推斷BA主要是通過被動擴散的方式吸收轉運，呈濃度依賴性。藥物在Caco-2細胞模型上的表觀滲透系數Papp與其口服吸收率密切相關，實驗結果顯示BA的Papp＜1×10-6cm/s，表明BA屬于吸收極差的化合物[23]，推測BA在人體的吸收率小于20%，這和BA較低的口服生物利用度的結果一致。加入維拉帕米和丙磺舒，BA 的Papp（AP-BL）值、Papp（BL-AP）值無顯著差異，由此可推斷，BA不是P-糖蛋白和多藥耐藥相關蛋白的底物。綜上，BA是一種口服吸收率極差的化合物，在Caco-2細胞中的攝取和轉運為被動擴散，且不是P-糖蛋白和多藥耐藥相關蛋白的底物。

5 結束語

本實驗成功建立了用LC-MS準確測定Caco-2細胞中BA含量的實驗方法。該方法在-ESI離子化方式下，以齊墩果酸為內標，通過檢測BA的碎片離子m/z455.4進行定量分析。該方法穩定性良好，靈敏度高、提取回收率高，生物樣本中內源性雜質無干擾，能有效應用于Caco-2細胞中BA的定量分析。本實驗采用LC-MS法對BA在Caco-2細胞上的攝取和轉運進行研究，預測BA在腸吸收情況，為合理設計其口服制劑研發提供實驗數據以及理論支持。