肺癌表皮生長因子受體基因突變分型特征及臨床意義研究

朱麗蒙，韓雪瑩，馬 楠，任曉妮，王小樂，張 暋

(鄭州金域臨床檢驗中心/鄭州市分子醫學診斷工程技術研究中心，河南 鄭州 450016)

根據2020年腫瘤年報，肺癌是河南省發病率和死亡率排第一的惡性腫瘤，中晚期肺癌的5年生存率僅為15%，給肺癌患者造成嚴重的生命威脅和巨大的經濟損失[1]。酪氨酸激酶抑制劑(TKI)可特異性結合表皮生長因子受體(EGFR)基因敏感突變位點，抑制腫瘤生長，改善晚期肺癌患者的生存和預后。美國國立綜合癌癥網(NCCN)2021年V1版《非小細胞肺癌診治指南》中提出，所有局部晚期或轉移性非小細胞肺癌(NSCLC)患者均應檢測EGFR，EGFR基因敏感突變位點陽性患者才有可能從EGFR-TKI的靶向治療中獲益[2]。

EGFR基因突變主要分布在酪氨酸激酶區域的18～21號外顯子上，已有報道的常見突變和罕見突變包括30余種，不同突變分型的靶向治療效果和突變率不同[3]。例如，EGFR基因19號外顯子缺失(19DEL)，約占肺癌EGFR突變的45%，預示患者對EGFR-TKI用藥敏感；21號外顯子L858R 突變也是主要的敏感突變類型，約占EGFR突變的40%；20號外顯子T790M突變，是第790位密碼子的蘇氨酸(T) 被蛋氨酸(M) 替代，導致 EGFR TK區域與靶向TKI藥物的親和力降低，從而產生耐藥，在獲得性耐藥患者中，突變率約占50%。因此，分析肺癌患者EGFR突變譜具有重要的臨床意義。研究表明，肺癌患者中，EGFR突變率與臨床特征和病理分型有關，女性、肺腺癌、多發轉移患者，EGFR基因突變率更高；而年齡、腫瘤病理分級和臨床分期則與EGFR基因總突變率有顯著相關性[4]。另外，不同地區由于遺傳、環境和生活習慣不同，患者的EGFR突變率可能會受到影響[5-6]。但不同地區和人群的EGFR基因突變譜的臨床特征目前研究尚不完善，傳統檢測技術對復合突變的檢出率低，需要高通量的檢測技術進行數據積累、研究和補充。臨床靶向治療中，攜帶不同EGFR分子分型的肺癌患者，對臨床靶向治療的影響不同，因此，急需EGFR基因分子分型的相關臨床研究，為肺癌分子診斷和靶向治療方案制定提供參考依據。

本文擬采用二代測序技術，檢測來自河南地區肺癌樣本中的EGFR基因突變，分析EGFR基因突變分型在肺癌中的典型特征，從而闡述EGFR基因突變譜和分子分型的臨床特征和意義，探討EGFR基因突變分型在肺癌輔助診斷和病理分型中的可能性，為肺癌的臨床診斷和靶向治療提供精準的基因參考信息。

1 資料與方法

1.1臨床資料 對2019年7月至2021年2月采集的895例肺癌患者樣本進行回顧性分析。患者均確診為肺癌，登記患者性別、年齡、病理分型、臨床癥狀、是否轉移等基本資料。樣本和患者資料來自河南省41個縣市的134家醫院，通過第三方醫檢公司鄭州金域臨床檢驗中心匯總檢測。本研究通過金域醫學倫理委員會審核，研究程序符合倫理要求。

1.2試劑與方法 福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)樣本，經病理蘇木精-伊紅(HE)染色，鏡下觀察視野內腫瘤細胞數占20%以上，并劃分刮取腫瘤細胞范圍，提取腫瘤DNA樣本。使用凱杰試劑盒(貨號：56404)采集血漿，血漿樣本體積要求2～4 mL。使用凱杰試劑盒(貨號：55184)提取血漿循環游離DNA(cfDNA)樣本。采用二代測序方法檢測已提取DNA中的EGFR全外顯子和部分內含子區域的點突變和小片段插入/缺失、剪切子變異、拷貝數變異突變。其中使用到KAPPA構庫試劑、IDT定制靶向探針、Illumina上機試劑(貨號：FC-404-2004)。結果經生物信息分析，采用bwa(0.7.10-r789)+Picard(v 1.128)+Genome Analysis Toolkit(GATK v3.5)等工具將測序原始數據轉變成易存儲、易理解的變體調用格式(vcf)，得出突變結果注釋表。依據美國《醫學遺傳學與基因組學學會解讀標準和分子病理報告指南》，參考腫瘤數據庫和人群數據庫，對結果注釋表進行人工分析和突變結果分類篩選。數據質控指標：Q30>0.85，捕獲特異性大于65%，靶向區域覆蓋度大于99%，去重后深度大于500X的靶向區域大于90%。要求檢測突變靈敏度達到0.5%。

1.3統計學處理 采用SPSS22.0統計軟件進行數據分析，計數資料以百分率(%)表示，采用χ2檢驗、連續校正χ2檢驗和Fisher確切概率法分析檢出率之間的統計學差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1樣本特征 895例肺癌患者中年齡23～91歲，年齡中位數67歲，不同年齡段數量分布見圖1。肺癌患者中肺腺癌315例，肺鱗癌40例；多發轉移性28例，肺占位42例，胸腔積液10例。按樣本類型分，共收集FFPE組織樣本779例，血漿樣本116例。

圖1 895例肺癌患者年齡特征

2.2.1不同臨床診斷組EGFR分型突變率比較 不同臨床診斷組的EGFR基因分子分型突變率與肺癌總突變率進行縱向結果對比統計見表1。組1中EGFR總突變率和各突變分型突變率與肺癌總體比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。組2中EGFR基因總突變率，T790M、20INS 2個分型的突變率與肺癌總體比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，但L858R、19DEL、EGFR擴增3個分型的突變率與肺癌總體比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。組3中EGFR總突變率和L858R、T790M 2個分型的突變率與肺癌總體比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，19DEL、20INS、EGFR擴增3個分型的突變率與肺癌總體比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。組4中EGFR基因總突變率和各基因突變型的陽性率與肺癌總體比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

表1 不同臨床診斷組EGFR分型突變率比較[ n(%)]

2.2.2不同病理分型組EGFR分型突變率比較 肺腺癌組EGFR總突變率和L858R、19DEL 2種分型的突變率與肺鱗癌組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，且肺腺癌突變率高于肺鱗癌組；T790M突變在肺鱗癌組中無陽性樣本。肺腺癌組20INS、EGFR擴增分型突變率與肺鱗癌組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。無統計學差異的2種突變分型均為EGFR-TKI耐藥機制。見表2。

表2 不同病理分型組EGFR分型突變率比較[ n(%)]

2.2.3不同性別組EGFR分型突變率比較 不同性別組間EGFR基因總突變率，L858R、19DEL、20INS、T790M 4種分型突變率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，女性突變率均高于男性。不同性別組間EGFR擴增突變率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同性別組EGFR分型突變率比較[ n(%)]

2.2.4不同標本類型組EGFR分型突變率比較 血漿cfDNA組EGFR基因總突變率和各分子分型突變率與組織FFPE組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。 組織FFPE組的總陽性、L858R、19DEL、擴增4種分型突變率略高于血漿cfDNA組，而20INS、T790M 2種分型突變率略低于血漿cfDNA組。見表4。20INS、T790M均為EGFR-TKI耐藥突變。拷貝數擴增的檢測，需要樣本中具有較為完整的DNA片段。分析突變頻率不同的原因可能跟標本臨床治療階段和標本DNA的完整度有關。

表4 不同標本類型的EGFR分型突變率比較[ n(%)]

2.3肺癌不同臨床組的EGFR基因突變數目分類特征 (1)按單突變和復合突變，肺腺癌和肺鱗癌的突變分型計數見表5。(2)按單突變和復合突變，有明確臨床診斷特征的EGFR突變陽性肺癌患者的突變類型統計數目見表6。

表5 肺腺癌和肺鱗癌突變分型計數表

續表5 肺腺癌和肺鱗癌突變分型計數表

表6 肺癌臨床組EGFR基因突變數目分類計數表

3 討 論

EGFR是肺癌中首個具有臨床意義的驅動基因，攜帶EGFR特定突變的肺癌患者，可能從靶向治療中獲益，從而延長該類患者的無進展生存期。本研究結果，河南地區895例肺癌患者EGFR突變率為53.97%，國內已有報道的各地區肺癌患者EGFR基因突變率為20%～60%，主要影響因素可能有檢測技術、研究人群、地區和遺傳等[5-8]。本研究結果表明，在EGFR的總突變率方面，女性肺癌患者高于男性，肺腺癌高于肺鱗癌，中高分化肺癌高于低分化肺癌，與已有研究結果一致[7-9]。同時，本研究發現，EGFR擴增在性別之間及肺腺癌和肺鱗癌之間均無統計學差異，提示EGFR基因突變率較低的男性或肺鱗癌患者，可關注EGFR擴增，尋找新的診斷治療方案。另外，本研究還發現EGFR分子分型在不同的患者和標本類型中有不同的分布特征。

3.1不同臨床診斷組EGFR分子分型特征 EGFR分子分型在不同的臨床診斷組中有不同的分布特征。HAYASHI等[10]研究表明，轉移性、侵襲性腫瘤中EGFR突變率較高，并可能常與EGFR基因復合突變同時出現，本研究肺癌多發轉移組中，EGFR基因突變率比肺癌總體和其他臨床組更高，同時，單突變和復合突變發生數目最多的均為轉移性腫瘤組，與HAYASHI等[10]研究一致。本研究肺癌轉移患者的EGFR基因突變分型特征，表現在L858R、19DEL、EGFR擴增3個分型的突變頻率比肺癌總體突變頻率高，L858R、19DEL為EGFR-TKI敏感突變，EGFR擴增可能導致EGFR蛋白過表達，文獻報道其可能是EGFR-TKI治療的不利因素，需要在治療中增加EGFR單抗類藥物[11-12]。提示檢測EGFR基因突變的同時，檢測EGFR擴增，可幫助肺癌轉移患者靶向治療制定全面的治療方案。

肺癌胸腔積液在晚期NSCLC患者的初診發生率為10%～15%，晚期NSCLC患者的胸腔積液與EGFR基因突變率有相關性[13]。本研究胸腔積液組EGFR基因突變率較高，與肺癌總體相比，有統計學差異的突變為L858R和T790M。T790M突變為一代和二代EGFR-TKI耐藥突變，三代EGFR-TKI敏感突變多為繼發突變，是常見的肺癌耐藥因素，也是更改靶向治療方案的主導因素。

3.2不同病理類型組EGFR分子分型特征 肺鱗癌和肺腺癌之間，EGFR基因突變分型特征主要體現在EGFR基因L858R和19DEL在肺腺癌中突變率較高，而EGFR基因擴增突變率在肺鱗癌中與肺腺癌中無統計學差異。PI等[14]研究了晚期肺腺癌中EGFR基因突變，所有突變類型中EGFR 19DEL基因突變率占50.7%，21號外顯子L858R基因突變率占43.4%，本研究結果與之接近。肺鱗癌中EGFR拷貝數擴增的突變率較高，其機制尚不明確。臨床數據表明，EGFR擴增的NSCLC患者生存時間較無EGFR擴增的患者短，但其與患者預后的相關性有待進一步研究[7]。另外，有文獻報道，在早期肺癌、腺癌及非吸煙的女性患者中，EGFR 基因外顯子突變常同時伴有EGFR基因的擴增[15]，本研究中，EGFR突變伴隨擴增，主要發生在肺腺癌中，占復合突變總數的40.62%(13/32)，可能與肺癌進展有關，而肺鱗癌中EGFR擴增以單突變為主。

3.3不同性別組EGFR分子分型特征 對比不同性別組間突變分型陽性率，L858R/19DEL/20INS均有顯著差異，且女性較高，而T790M/擴增無統計學差異，EGFR基因擴增在男性中的數量高于女性。可知，男性和女性有不同的EGFR基因突變分型特征，EGFR突變陰性的男性肺癌患者可關注EGFR基因擴增的檢測，擴大靶向治療指導用藥范圍。

3.4不同標本類型組EGFR分子分型特征 液體活檢主要針對cfDNA和循環腫瘤細胞(CTCs)。其中cfDNA是肺癌中研究最多、被廣泛采用的腫瘤基因分型來源，已經進入了檢測敏感和耐藥EGFR突變的臨床實踐。近幾年，通過下一代測序進行更全面的血漿基因分型已被應用于臨床，并從晚期/轉移性疾病轉移到新的前沿，如早期檢測和微小殘留病灶評估[16]。一項AURA試驗的回顧性分析結果表明，液體活檢的EGFR基因突變與組織活檢的陽性一致性為61%[17]，但本研究血漿標本和組織標本總突變率和各突變分型之間無統計學差異。分析原因可能是臨床有選擇性送檢，血漿樣本主要來源為轉移性肺癌和耐藥后基因監測，因而EGFR突變率升高，另外，高通量測序技術(NGS)的使用提高了檢測的靈敏度，可能檢出cfDNA中的低頻突變，使EGFR突變率升高。從EGFR分子分型來看，本研究cfDNA樣本比FFPE樣本中的T790M突變率高，但拷貝數擴增和19DEL突變率較低，提示游離血漿中DNA碎片化，可能影響小片段擴增或缺失突變的檢測。

EGFR基因檢測在肺癌臨床中主要用于指導靶向治療，但其突變分型特征和臨床應用價值尚缺少強有力的臨床研究。本文闡述了河南地區EGFR基因突變分型的突變率特征，結果表明，不同患者有不同的EGFR突變分型特征，同時，NGS檢測EGFR突變分型具有檢測面廣、靈敏度高、可同時檢測多種突變類型等優勢，游離血漿也可作為組織樣本的有效補充。但本研究缺少臨床治療相關資料，未來還需臨床治療數據對EGFR分子分型的臨床意義進行驗證。