大鼠Sesn2/AMPK信號介導肝臟的自噬在間歇低氧和復氧致糖代謝異常中的作用

陳新潔，劉宏飛，田稼薈，靳歡歡，呂云輝，韓 芳，魏翠英

2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)患者中阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS)的患病率高達23.8%～53.0% ，它們之間存在明顯關聯[1]。OSAHS的主要特征是慢性間歇低氧，這會激活氧化應激，釋放炎癥因子，影響糖脂代謝，進而導致胰島素抵抗的發生。上述均依賴于單磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的活化，AMPK在調節能量穩態和代謝應激方面有重要價值[2]，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是AMPK下游蛋白，可調節細胞生長和增殖， AMPK-mTOR信號通路是重要的信號調節途徑，在自噬中起重要作用[3]。Sesn2是調控通路的關鍵因素，通過激活AMPK來抑制細胞內mTOR的激活，從而改善糖代謝疾病，如葡萄糖耐量減低、胰島素抵抗[4]。目前尚無文獻報道Sesn2在間歇低氧中的調控機制。因此研究Sesn2/AMPK信號對間歇低氧致胰島素抵抗的相關機制是非常有意義的。該研究擬建立間歇低氧大鼠模型，對照觀察間歇低氧和復氧下，Sesn2、AMPK、p-AMPK、mTOR、LC3在肝臟組織中的表達水平，探討Sesn2/AMPK信號介導的自噬在間歇低氧和復氧致糖代謝異常中的作用，為OSAHS引起糖代謝紊亂的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料5周齡雄性清潔SD大鼠48只，體質量180～200 g，由包頭醫學院實驗動物中心提供。大鼠胰島素ELISA試劑盒購自華美生物工程有限公司，抗AMPK、p-AMPK、Sesn2抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔多克隆抗體購自美國Affinity公司，HyPure TMMolecular Biology Grade Water購自美國HyClone公司，Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit，2×SYBR Green qPCR Master Mix(High ROX)，RNA提取液均購于武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1動物分組 按隨機數字表法分組：即對照組(NC)、慢性間歇低氧組(CIH)。① 基線階段：大鼠適應性飼養1周。隨機選取兩組8只大鼠并取樣，即A組(基線NC組)、B組(基線 CIH 組)，剩余大鼠進入間歇低氧階段。② 間歇低氧階段：CIH組大鼠除了在低氧艙內不予飲食，其余時間均正常飲食，而NC組大鼠置于常氧下正常飼養，共持續8周。每組隨機選取8只大鼠并取樣，即C組(NC組常氧8周末)、D組(CIH組間歇低氧8周末)。③ 復氧階段：CIH組剩余大鼠進行復氧干預處理，NC組繼續常氧下正常飼養，持續4周后取樣，即E組(NC 組常氧12周末)、F組 (CIH組復氧4周末)。

1.2.2OSAHS模型的建立 自制全自動間歇低氧艙，制備間歇低氧大鼠模型。氧艙分兩部分，上部為操作平臺，下部為間歇低氧艙，采用封閉式抽屜設計，以便于抓取實驗大鼠及更換墊料。實驗溫度維持在22～23 ℃，濕度調節至42%～45%。以120 s為1個循環，通入氮氣25 s，使艙內氧濃度由21%降至7%～8%，維持10 s，通入氧氣55 s，氧濃度逐漸上升至21%，維持30 s，使大鼠發生間歇低氧事件為30次/h，模擬人類重度OSAHS事件。艙內氧濃度由便攜式測氧儀實時監控，艙底鋪有干燥墊料及生石灰來吸收水分及CO2。在間歇低氧艙內部氧濃度達到最低點及恢復至最高點時抽取SD大鼠頸動脈血，進行血氣分析，檢測最低點、最高點時的動脈血氧飽和度(arterial oxygen saturation，SaO2)。驗證造模成功后，CIH組大鼠放入間歇低氧艙內，暴露時間為每日9:00—17:00(共8 h)，共8周。

1.3 取材大鼠處死前禁食12 h，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，內眥靜脈法取血，留取肝臟組織備用。

1.4 生化檢測迅速用毛細玻璃管吸取微量血液滴于血糖儀試紙上測定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)；采用ELISA法檢測空腹胰島素(fasting insulin,FINS)水平；采用血清穩態模型評估胰島素抵抗指數(homeostasis model insulin resistance index,HOMA-IR)=(FBG×FINS)/22.5。

1.5 Western blot法檢測Sesn2、AMPK、p-AMPK蛋白的表達水平從-80 ℃冰箱中取肝組織，冰浴下制成10%肝勻漿液。提取總蛋白，BCA測定蛋白質濃度。取相同量蛋白用于10% SDS-PAGE凝膠分離、濃縮蛋白，并轉移至NC膜，BSA室溫封閉60 min。TBST溶液洗滌后分別加入稀釋度為1 ∶1 000的一抗，4 ℃搖床孵育過夜，然后再次洗膜，加入二抗(1 ∶5 000)在室溫下孵育1 h，然后進行清洗、顯色和圖片采集。應用Image J軟件進行條帶灰度值分析，計算蛋白的相對表達量。

1.6 RT-PCR法檢測LC3、mTOR mRNA的表達用RNA抽提試劑盒提取肝臟組織總RNA，經過RNA純度、完整性鑒定后，將其反轉錄為cDNA，LC3、mTOR，以GAPDH作為內部參照。GAPDH上游和下游引物分別是5′-CTGGAGAAACCTGCCAAG TATG-3′和5′-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3′；LC3上游和下游引物分別是5′-ATCAACATTCTGACGG AGCGG-3′和5′-ATCTGCCTGCTTGTCCTGGTT-3′；mTOR的上游和下游引物分別為5′-GGGTGAC GAGCTCTTTGTCA-3′和5′-AGGAGCCCTAACACTCG GAT-3′。PCR反應參數為：95 ℃預變性10 min，隨后95 ℃變性15 s，60 ℃退火、延伸60 s，進行40個循環。實驗重復3次，采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠的一般狀態NC組大鼠精神狀態良好、呼吸平穩、皮毛光亮、活動自如、反應靈敏；CIH組大鼠在進入間歇低氧艙后首先出現煩躁不安、四處竄動，10 min后出現活動遲緩、呼吸急促、口唇及四肢發紺等缺氧現象，隨實驗進行逐漸表現為皮毛灰暗、精神萎靡等。

2.2 間歇低氧引起FBG、FINS、HOMA-IR水平升高基線時，A、B組的FBG、FINS、HOMA-IR差異無統計學意義(P>0.05)；間歇低氧8周后，與C組比較，D組FBG、FINS、HOMA-IR升高(t=-2.32、-5.64、-5.51,均P<0.05)，差異有統計學意義；復氧干預4周后，E、F組的上述指標差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR水平比較

2.3 Sesn2、AMPK、p-AMPK蛋白水平的表達基線時，A、B組Sesn2、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；間歇低氧8周時，與C組比較，D組Sesn2、p-AMPK/AMPK表達水平降低[(0.55±0.16)vs(0.89±0.07)、(0.42±0.11)vs(0.85±0.24)，均P<0.05]，差異有統計學意義；復氧干預4周后，與E組比較，F組Sesn2、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；與D組比較，F組Sesn2、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平增加[(0.83±0.09)vs(0.55±0.16)、(0.78±0.12)vs(0.42±0.11),均P<0.05]，差異有統計學意義。見圖1、2。

圖1 各組肝臟Sesn2/β-actin比值

圖2 各組肝臟p-AMPK/AMPK比值

2.4 自噬蛋白LC3、mTOR的mRNA水平基線時，A組和B組LC3、mTOR mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；間歇低氧8周時，與C組比較，D組LC3 mRNA表達水平下降(t=9.77,P<0.05)，mTOR mRNA表達水平升高(t=-21.87,P<0.05)，差異有統計學意義；復氧干預4周后，與E組比較，F組LC3、 mTOR mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；與D組比較，F組LC3 mRNA表達水平升高(t=6.66,P<0.05)，mTOR mRNA表達水平下降(t=6.03,P<0.05)，差異有統計學意義。見表2。

表2 各組大鼠LC3、mTOR mRNA水平比較

3 討論

臨床上常見OSAHS與T2DM的并存現象，導致患者心腦卒中、猝死風險顯著增高。胰島素抵抗是T2DM的主要發病機制之一，它貫穿T2DM演變的全過程。研究[5]報道OSAHS及其相關的全身性間歇低氧是代謝異常(如胰島素抵抗和糖耐量降低)的獨立危險因素，具體的作用機制日益受到人們的重視。由于臨床上無法確定OSAHS與T2DM的因果關系，因此本研究擬構建大鼠間歇低氧模型，模擬人類重度OSAHS事件，深入探討間歇低氧與糖代謝的關系及可能的機制。

大多數文獻報道[6-8]，間歇低氧可導致血糖和胰島素水平的增高，但很少有研究報道復氧是否能夠逆轉變這種改變。本研究結果顯示：在間歇低氧8周后，大鼠FBG、FINS和HOMA-IR水平升高，復氧干預4周FBG和FINS水平逐漸下降，恢復至基線水平。提示：間歇低氧可以導致胰島素抵抗，血糖增高，而復氧干預后可以完全逆轉這種改變，證明間歇低氧是糖代謝異常的直接原因。

研究[9]表明間歇低氧可通過全身性作用(包括交感神經興奮，炎癥或氧化應激)以及對脂肪、肝臟和胰腺組織的直接作用來影響葡萄糖代謝。AMPK是能量感受器，參與細胞新陳代謝的調節，控制凋亡、自噬等生理機制，mTOR通過合成代謝調節細胞的生長和繁殖，AMPK/mTOR信號通路不僅是細胞內能量代謝監測系統中的重要節點，而且是調節自噬的重要上游信號通路[10]。

目前尚無相關文獻探究肝臟中AMPK/mTOR信號通路在間歇低氧和復氧的調控機制。本研究與Thomas et al[6-7]結果一致，間歇低氧下大鼠肝臟組織的AMPK蛋白表達顯著降低，mTOR持續激活，影響了肝臟的糖代謝，引起FINS、FBG增高，從而導致胰島素抵抗的發生。

Sesns是一種應激誘導蛋白，在哺乳類動物的表達有3種(Sesn1～3)，其生物學功能是mTOR的抑制劑，可促進自噬的發生。Sesn2被認為可以減輕各種與年齡相關的代謝紊亂，包括胰島素抵抗、葡萄糖耐量異常[11]。因此Sesn2是調控AMPK/mTOR通路的關鍵因素，可能成為治療糖尿病的新靶點[12]。

本研究表明Sesn2在應對間歇低氧環境時，出現低水平表達，正如Sun et al[11]證明，Sesn2的缺乏會增加胰島素抵抗和糖尿病的進展。進一步發現自噬因子LC3 mRNA表達顯著下降，正如研究[13-14]發現，肝臟的自噬作用可通過mTOR的持續激活而受到抑制，進而使胰島素信號減弱，誘發胰島素抵抗。Li et al[15]揭示了Sesn2誘導的自噬通過激活AMPK信號來恢復受損的胰島素信號，改善胰島素抵抗。同樣，本研究證實了間歇低氧下調Sesn2的表達，通過抑制AMPK通路及下游自噬調節，影響機體能量代謝，引起糖代謝紊亂，導致胰島素抵抗。復氧干預后，Sesn2、AMPK蛋白、LC3 mRNA回升，mTOR蛋白回落，再次驗證Sesn2/AMPK信號誘導自噬參與了間歇低氧致胰島素抵抗的機制。文獻證實[6，8]，間歇低氧引起大鼠各種組織AMPK的表達下降或升高。間歇低氧下，AMPK的表達是否存在組織特異性？未來有條件，進一步探索在間歇低氧下，Sesn2/AMPK信號在胰島素的其他靶器官的表達情況。

綜上所述，間歇低氧可能通過抑制Sesn2/AMPK信號及自噬的發生，導致大鼠FBG、FINS增高，從而介導胰島素抵抗。