高尿酸通過氧化應激誘導心肌細胞胰島素抵抗

陳映群，張衛星，李 智

高尿酸已經被證實與心血管疾病密切相關，包括高血壓、缺血性心臟病、心力衰竭和心源性猝死等[1-5]。動物實驗發現高尿酸可加重缺血/缺氧條件下小鼠心肌細胞凋亡[6]。臨床研究[7]表明高尿酸血癥是胰島素抵抗的獨立危險因素，基礎研究證明高尿酸能誘導肝臟、肌肉和脂肪細胞的胰島素抵抗。研究[8]證實胰島素抵抗是影響心衰預后的一個標志物。然而，高尿酸血癥是否可以通過誘導心肌細胞胰島素抵抗影響心功能目前仍不清楚。高尿酸可增加多種靶細胞內氧化應激[9-10]，課題組前期研究[5]表明高尿酸處理后肝細胞和胰腺β細胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生增加，且與胰島素抵抗有關。高尿酸在胰島素抵抗及心臟功能障礙中是否起到關鍵作用尚未確定。該研究通過體外原代心肌細胞、H9c2心肌細胞株實驗以及高尿酸動物模型，探討高尿酸對細胞內氧化應激、胰島素信號通路和胰島素抵抗的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑熒光標記葡萄糖2-(N-7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑-4-氨基)-2-脫氧-D-葡萄糖(簡稱：2-NBDG)購自美國Invitrogen公司；氧化應激熒光探針2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(簡稱：DCFH-DA)、尿酸購自美國Sigma公司；抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸(簡稱：NAC)購自美國ENZO Life Sciences公司；磷酸化Akt(Ser473)和Akt抗體購自美國Bioworld公司；磷酸化IRS1(Ser307)和IRS1(Ser307)抗體購自美國Millipore公司；兔GAPDH抗體購自美國Abcam公司。所有化學試劑具有分析純級。尿酸儲備溶液濃度為15 mg/ml，最終實驗濃度為15 mg/dl；NAC儲備溶液濃度為500 mmol/L，最終實驗濃度為5 mmol/L。

1.2 細胞培養與處理細胞研究使用H9c2大鼠心臟來源的胚胎肌細胞，用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素的DMEM或低糖DMEM作為培養基進行細胞培養，在37 ℃含5%CO2和95%空氣的細胞培養箱中孵育。根據試驗目的將細胞實驗分為兩部分：① 明確高尿酸可使心肌細胞內ROS增加，心肌細胞實驗分組為：對照組(Control)、高尿酸作用組(HUA)、抗氧化劑作用組(NAC)、抗氧化劑+高尿酸作用組(NAC+HUA)；② 明確高尿酸通過氧化應激抑制心肌細胞對葡萄糖的攝取并誘導心肌細胞胰島素抵抗，心肌細胞實驗分組為：對照組(Control)、高尿酸作用組(HUA)、抗氧化劑作用組(NAC)、抗氧化劑+高尿酸作用組組(NAC+HUA)、胰島素作用組(Insulin)、胰島素+高尿酸作用組(Insulin+HUA)、抗氧化劑+胰島素作用組(NAC+Insulin)、抗氧化劑+胰島素+高尿酸作用組(NAC+Insulin+HUA)。將細胞以2.0×105個/ml密度接種在6孔板；在含高尿酸處理組，將細胞與含有15 mg/dl尿酸在新鮮細胞培養基中孵育24 h；含抗氧化劑NAC作用組，將細胞與含5 mmol/L NAC新鮮細胞培養基預處理30 min；然后收集細胞用于生物化學或分子測定。所有實驗至少重復3次。

1.3 熒光顯微鏡分析心肌細胞對熒光葡萄糖攝取使用熒光顯微鏡(CX21倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司)對心肌細胞對熒光葡萄糖攝取進行定性分析。2-NBDG是一種2-脫氧熒光葡萄糖的類似物，被細胞吸收以后，由于無法代謝而在細胞內積累，因此可作為細胞葡萄糖代謝的示蹤劑，熒光強度反映了葡萄糖吸收的情況。本實驗通過熒光葡萄糖類似物2-NBDG評估H9c2心肌細胞對的葡萄糖攝取。用含FBS的低糖DMEM培養基處理細胞24 h，然后用含有胰島素(100 nmol/L)和2-NBDG(100 μmol/L)的KRB緩沖液替換培養基。在37 ℃下作用30 min，用激發和發射波長分別為485 nm和535 nm的熒光測定H9c2心肌細胞對的葡萄糖攝取。

1.4 流式細胞儀分析心肌細胞對熒光葡萄糖攝取使用流式細胞儀(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)對心肌細胞對熒光葡萄糖攝取進行定量分析。用含FBS的低糖DMEM培養基處理細胞24 h，然后用含有胰島素(100 nmol/L)和2-NBDG(100 μmol/L)的KRB緩沖液替換培養基在37 ℃下30 min。處理后從培養基中洗去游離的2-NBDG，分別在激發和發射波長為488 nm和525 nm下通過流式細胞術測量心肌細胞對葡萄糖2-NBDG的攝取。數據分析使用流式細胞儀相關軟件。統計分析使用單因素方差分析及Tukey-Kramer多重比較分析。

1.5 細胞內活性氧ROS測定將細胞在6孔板(2.0×105個/孔)中傳代培養并使其附著作用于高尿酸24 h，并如上所述在37 ℃用10 mmol/L DCFH-DA染色30 min。通過熒光顯微鏡對染色的細胞成像，并分別在激發和發射波長為530 nm和480 nm下通過流式細胞術對細胞內ROS分析。

1.6 急性高尿酸模型的構建8周齡C57BL/6J雄性小鼠，體質量(20±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。經汕頭大學醫學院動物倫理委員會批準。給予標準飲食，實驗前經過1周的環境適應時間。取9周齡小鼠12只，隨機選擇6只作為對照組，另外6只作為實驗組。對照組和實驗組小鼠禁食過夜，對照組根據體質量給予0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃和腹腔注射，實驗組給予500 mg/kg次黃嘌呤灌胃以及300 mg/kg氧嗪酸鉀腹腔注射處理；用磷鎢酸法檢測不同時間(0、1、2、3、4、6 h)小鼠血清中尿酸水平，建立急性高尿酸模型。

2 結果

2.1 高尿酸抑制胰島素誘導的H9c2心肌細胞對葡萄糖攝取為了確定高尿酸是否在體外誘導心肌細胞胰島素抵抗，將H9c2心肌細胞用不同濃度(0、5、10、15、20 mg/dl)的尿酸預處理不同時間(0、0.5、1.0、8.0、16.0、24.0 h)，通過流式細胞儀對胰島素刺激的心肌細胞2-NBDG攝取進行測定，結果發現胰島素顯著增加H9c2心肌細胞中2-NBDG攝取，高尿酸(15 mg/dl)預處理24 h后明顯抑制心肌細胞胰島素誘導的2-NBDG攝取率[(23.13±1.92)%vs(72.85±4.88)%，P<0.05]。因此，高尿酸誘導心肌細胞胰島素抵抗并抑制胰島素刺激下心肌細胞葡萄糖的攝取。見圖1。

圖1 尿酸對H9c2心肌細胞2-NBDG攝取的影響

2.2 高尿酸誘導H9c2心肌細胞的氧化應激與Control組比較，高尿酸預處理24 h后H9c2心肌細胞內的ROS水平明顯升高[Control:(4.15±0.89)%vsHUA:(50.03±4.53)%，P<0.05]。用抗氧化劑NAC預處理能夠部分逆轉心肌細胞內高尿酸產生的ROS[HUA+NAC:(17.55±1.85)%vsHUA:(50.03 ± 4.53)%，P<0.05]，表明高尿酸可直接引起H9c2心肌細胞的氧化應激。見圖2。

圖2 高尿酸對H9c2心肌細胞ROS的影響

2.3 高尿酸通過氧化應激誘導H9c2和原代心肌細胞胰島素抵抗抗氧化劑NAC預處理逆轉了高尿酸抑制的胰島素誘導H9c2心肌細胞2-NBDG葡萄糖攝取[NAC+Insulin+HUA:(62.20±4.51)%vsInsulin+HUA:(31.98±3.74)%，P<0.05]，表明氧化應激在高尿酸誘導的心肌細胞胰島素抵抗中起到關鍵作用。見圖3。

圖3 高尿酸對H9c2心肌細胞2-NBDG葡萄糖攝取的影響

2.4 高尿酸激活心肌細胞胰島素負調節蛋白IRS1(Ser307)磷酸化，抑制胰島素信號蛋白Akt磷酸化與激活胰島素信號傳導的其他磷酸化位點的IRS1(Ser307)比較，磷酸化IRS1(Ser307)抑制胰島素信號傳導。在本研究中，高尿酸增加H9c2心肌細胞中的磷酸化IRS1(Ser307)水平(HUAvsControl：P<0.01，F=27.71)。此外，高尿酸部分逆轉了胰島素對H9c2心肌細胞中磷酸化IRS1(Ser307)的抑制(HUA+InsulinvsInsulin：P<0.01，Q=11.70)。為了確定高尿酸誘導的氧化應激是否激活H9c2心肌細胞中的磷酸化IRS1(Ser307)，課題組用抗氧化劑NAC預處理細胞觀察高尿酸誘導磷酸化IRS1(Ser307)水平的表達。NAC抵消了高尿酸誘導的磷酸化IRS1(Ser307)過表達(NAC+HUAvsHUA：P<0.05，Q=4.79)，表明氧化應激在高尿酸誘導心肌細胞胰島素抵抗中起到關鍵作用。見圖4A。

圖4 高尿酸對H9c2心肌細胞磷酸化IRS1(Ser307)及磷酸化Akt的影響

Akt是胰島素依賴性PI3K通路在信號轉導過程中激活的Ser/Thr蛋白激酶。課題組檢測了高尿酸在H9c2細胞中是否抑制了胰島素誘導的Akt磷酸化，結果顯示高尿酸顯著抑制胰島素誘導的磷酸化Akt水平(HUA+InsulinvsInsulin：P<0.01，Q=9.45)。見圖4B。

另外，課題組進一步討論了抗氧化劑NAC對高尿酸抑制心肌細胞Akt磷酸化的影響。NAC不影響胰島素誘導的磷酸化Akt水平，但明顯改善高尿酸對胰島素誘導的磷酸化Akt的抑制(NAC+HUA+InsulinvsHUA+Insulin：P<0.05，Q=5.08)。抗氧化劑逆轉高尿酸對磷酸化Akt水平的抑制，證明氧化應激在高尿酸對胰島素下游信號通路具有重要影響。見圖4B。

2.5 高尿酸血癥增加磷酸化IRS1(Ser307)水平并抑制小鼠心肌組織中胰島素誘導的Akt磷酸化高尿酸血癥小鼠模型中血清尿酸水平高于誘導前，這與原發性高尿酸血癥患者一致。在葡萄糖或胰島素注射后15和30 min，小鼠模型顯示葡萄糖耐量受損(P<0.05，圖5A)和胰島素耐受(P<0.05，圖5B)。進而檢測急性高尿酸血癥對小鼠模型的心臟組織中的胰島素信號通路蛋白的影響。胰島素腹膜內注射高尿酸血癥小鼠10 min，然后處死獲得心肌組織。高尿酸血癥增加小鼠心肌組織中IRS1(Ser307)的磷酸化水平(P<0.01，圖5C)；在急性高尿酸血癥小鼠的心肌組織中磷酸化Akt水平明顯低于對照組(P<0.05，圖5D)，表明高尿酸血癥在體內明顯影響胰島素下游信號通路的傳導。高尿酸通過氧化應激激活磷酸化IRS1(Ser307)水平，進而抑制Akt(Ser 437)磷酸化，從而導致心肌細胞胰島素抵抗(圖5E)。

圖5 高尿酸血癥誘導小鼠心肌組織胰島素抵抗及示意圖

3 討論

本研究討論了高尿酸誘導對心肌細胞胰島素抵抗及葡萄糖攝取的影響。高尿酸血癥與許多心血管疾病密切相關[1]，如心力衰竭、高血壓和冠狀動脈疾病，但缺乏解釋這種關聯的病理機制。體外高尿酸增加胰腺β細胞、脂肪細胞和系膜細胞的氧化應激[7-8]，而研究表明氧化應激是許多細胞類型(包括心肌細胞)中胰島素抵抗的主要介質[10-11]。此外，胰島素抵抗是心力衰竭患者死亡的危險因素，心肌氧化應激通常伴有胰島素抵抗[12-13]。高尿酸可以加重胰島素抵抗，這在課題組前期的研究[5]中得到證實：證明高尿酸可以通過氧化應激直接誘導心肌細胞胰島素抵抗。本研究結果為高尿酸作為心血管疾病的獨立危險因素提供了新的證據，為高尿酸如何抑制心肌細胞葡萄糖代謝及高尿酸相關心血管疾病提供新的解釋。

研究[14]表明細胞內胰島素信號通路通過調節細胞葡萄糖代謝來調節細胞代謝、生長和存活，心臟生長和代謝是通過復雜的細胞外和細胞內信號整合來協調。高尿酸明顯抑制了心肌細胞中胰島素誘導的葡萄糖攝取，導致胰島素抵抗，但高尿酸是通過何種機制誘導心肌細胞胰島素抵抗并抑制了心肌細胞對葡萄糖的攝取，仍不得而知。

已有研究[15]表明骨骼肌中H2O2誘導的氧化應激與胰島素抵抗有關，本研究發現高尿酸直接增加了心肌細胞內活性氧水平，提示高尿酸誘導了心肌細胞氧化應激。此外，課題組檢測了抗氧化劑NAC在高尿酸抑制胰島素刺激下心肌細胞葡萄糖攝取的影響，結果發現在心肌細胞中，抗氧化劑NAC明顯逆轉了心肌細胞中高尿酸抑制胰島素刺激的2-NBDG攝取，結果表明高尿酸通過氧化應激誘導的胰島素抵抗從而抑制了心肌細胞對葡萄糖的攝取，這與新近一項研究[16]相符，該研究顯示氧化應激可誘導心肌細胞胰島素抵抗進而增加H9c2心肌細胞凋亡。

本研究討論了高尿酸誘導心肌細胞胰島素抵抗的機制，高尿酸通過降低葡萄糖攝取來改變心肌細胞能量代謝，高尿酸誘導的心肌細胞胰島素抵抗可能導致心臟功能障礙，為高尿酸血癥相關代謝性心血管疾病的提供了新的證據。然而，本研究僅從體外細胞實驗證實了高尿酸通過氧化應激誘導的胰島素抵抗從而抑制了心肌細胞對葡萄糖的攝取，但人高尿酸血癥是一種慢性過程，需要進一步在動物模型上研究高尿酸血癥和胰島素抵抗的關系。